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    傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室生物學(xué)是一種小規(guī)模操作；組織培養(yǎng)器皿很少會(huì)大于實(shí)驗(yàn)者的手掌，容量度量以“毫升”為單位，蛋白純化能夠產(chǎn)出幾微克就算大功告成。隨著人們?cè)絹?lái)越關(guān)注轉(zhuǎn)化研究、結(jié)構(gòu)生物學(xué)和再生醫(yī)學(xué)，很多科學(xué)家開始從“大”處著眼。無(wú)論是試著純化幾克蛋白進(jìn)行結(jié)晶實(shí)驗(yàn)，還是測(cè)試全新基因產(chǎn)物發(fā)展成新藥的可行性，這些研究者很快就會(huì)發(fā)現(xiàn)自己開始思索復(fù)雜的大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)。
 

    多虧了生物技術(shù)工業(yè)的成就，細(xì)胞培養(yǎng)的縱向擴(kuò)展已經(jīng)是一條康莊大道。“這個(gè)領(lǐng)域已經(jīng)迸發(fā)出來(lái)，因?yàn)榇罅康漠a(chǎn)品層出不窮，在非常大的生物反應(yīng)器中，藥物能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中大批量的生產(chǎn)出來(lái)。”位于美國(guó)馬里蘭州貝塞斯達(dá)市的國(guó)家糖尿病、消化與腎病研究所生物技術(shù)核心實(shí)驗(yàn)室主任 Joseph Shiloach 補(bǔ)充道，取決于細(xì)胞類型，必需的設(shè)備和試劑通常有現(xiàn)貨**。

    檢視懸浮培養(yǎng)

    對(duì)很多科學(xué)家來(lái)說(shuō)，大批量的細(xì)胞生長(zhǎng)最顯見(jiàn)的選擇是采用他們?cè)缫咽熘募夹g(shù)：懸浮培養(yǎng)。大量的細(xì)胞系已經(jīng)能夠適應(yīng)小旋轉(zhuǎn)瓶的生長(zhǎng)環(huán)境，因此最初的規(guī)模擴(kuò)大就只是買個(gè)更大的旋轉(zhuǎn)瓶。懸浮培養(yǎng)也為研究者進(jìn)一步擴(kuò)展提供了多種選擇。

    在搖瓶中進(jìn)行培養(yǎng)尤為靈活，研究者可以通過(guò)在單個(gè)平臺(tái)上逐步擴(kuò)大尺寸來(lái)加快速度。“你可以弄一個(gè)小尺寸的平臺(tái)（搖床）放在恒溫箱中，而且……可以從只有幾毫升培養(yǎng)物的試管開始，然后一直擴(kuò)大到在大的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)數(shù)升的培養(yǎng)物。”位于加州卡爾斯巴德的生命技術(shù)公司細(xì)胞生物學(xué)高級(jí)產(chǎn)品經(jīng)理 Henry Chiou 表示。

    必要時(shí)，適用于搖床或者旋轉(zhuǎn)瓶的懸浮培養(yǎng)法通常很容易擴(kuò)展到更大的尺寸。“你可以嘗試不同類型的搖瓶和旋轉(zhuǎn)瓶去滿足最開始工作時(shí)所需的體積，而如果你需要再增加一點(diǎn)點(diǎn)體積，就可以采用小型的生物反應(yīng)器。” Shiloach 說(shuō)。

    生物制藥行業(yè)例行采用在生物反應(yīng)器中的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)制造臨床獲準(zhǔn)產(chǎn)品，因此供貨商制造出的系統(tǒng)規(guī)格從臺(tái)式到工業(yè)規(guī)模的都有。如今，這樣的生物反應(yīng)器很多都使用了一次性的培養(yǎng)室以避免滅菌的困難。“整個(gè)生物反應(yīng)器都是一次性的，所以購(gòu)買時(shí)一切所需都已經(jīng)裝配好了，你只需要加入培養(yǎng)基。” Shiloach 說(shuō)。他接著說(shuō)，“你可以在初期操作時(shí)使用小一點(diǎn)的發(fā)酵罐，非常類似于搖瓶，你可以將其拿進(jìn)通風(fēng)廚，你可以將其進(jìn)行接種……，而后你可以把它放起來(lái)并連接到系統(tǒng)中。”

    一開始從小規(guī)模到大一些規(guī)模的旋轉(zhuǎn)瓶或搖瓶培養(yǎng)，甚至到小型生物反應(yīng)器都看起來(lái)挺簡(jiǎn)單的，但隨著規(guī)模增長(zhǎng)，就會(huì)突然出現(xiàn)新的問(wèn)題。大型生物反應(yīng)器通常需要更復(fù)雜的硬件支撐，并需要為維持pH值和養(yǎng)分水平進(jìn)行更細(xì)致而頻繁的測(cè)試，研究者可能需要額外的操作培訓(xùn)。“一旦你開始規(guī)模擴(kuò)大并需要特定的產(chǎn)量，這個(gè)產(chǎn)量就會(huì)特別依賴于細(xì)胞的健康程度。” Chiou 補(bǔ)充道，“仔細(xì)地監(jiān)控你的培養(yǎng)變得尤為重要。”

    一些供貨商提供了略微不同的旋轉(zhuǎn)瓶、懸浮培養(yǎng)瓶和生物反應(yīng)器，通常是為解決具體問(wèn)題做出的全新改動(dòng)。舉例來(lái)說(shuō)，位于紐約州華盛頓港的頗爾生命科學(xué)公司目前正在消瘦一種臺(tái)式的生物反應(yīng)器，能夠攪動(dòng)裝滿細(xì)胞和培養(yǎng)基的一次性塑料袋。這個(gè)袋子放置在一個(gè)特殊的搖床頂上，通過(guò)兩個(gè)單獨(dú)的軸線來(lái)回?cái)[動(dòng)。低剪切力與一次性培養(yǎng)室的結(jié)合有助于維持從一批細(xì)胞到下一批細(xì)胞的一致性。位于美國(guó)新澤西州皮斯卡塔韋市的通用電氣醫(yī)療集團(tuán)生命科學(xué)部使用的方式類似于其WAVE生物反應(yīng)器，這一反應(yīng)器的特色也是在擺動(dòng)的平臺(tái)上的一次性袋狀生長(zhǎng)室，尺寸大小從 100 毫升到 500 升不等。

    鑒于各方面的選擇，科學(xué)家需要花些時(shí)間去考慮哪種方式是最有效的。特別是對(duì)于需要保持溶解氧和pH值等參數(shù)時(shí)， Shiloach 建議詢問(wèn)支持設(shè)備并檢測(cè)每個(gè)系統(tǒng)之所需。如果一個(gè)系統(tǒng)看上去很適合， Shiloach 說(shuō)，“我認(rèn)為最好的方法是搞一臺(tái)試試。”

    寧“轉(zhuǎn)”勿戰(zhàn)

    當(dāng)選擇的細(xì)胞無(wú)法在懸浮狀態(tài)下生長(zhǎng)，一些研究者需要尋找其他方法來(lái)擴(kuò)大規(guī)模，亦或不必如此。很多情況下，最明智的選擇還是轉(zhuǎn)向懸浮培養(yǎng)。“如果你有一個(gè)產(chǎn)物需要檢測(cè)，而且你只需要幾毫克來(lái)檢測(cè)它的生物活性是否是你想要的，你可以從貼壁（細(xì)胞）開始做起，但如果產(chǎn)物看起來(lái)不錯(cuò)，我想最好還是試著改變這些細(xì)胞，或是試試另一個(gè)細(xì)胞系……然后就使用懸浮培養(yǎng)。” Shiloach 說(shuō)。

    如果目標(biāo)是臨床治療，那么轉(zhuǎn)變細(xì)胞系也可能會(huì)幫助加速監(jiān)管部門的審批過(guò)程。像中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO）和人類胚胎腎細(xì)胞 293（HEK-293）等已建立起來(lái)的懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)形成了目前生物制藥生產(chǎn)的支柱，因此監(jiān)管部門已經(jīng)對(duì)此頗為習(xí)慣。

    轉(zhuǎn)向適應(yīng)懸浮的細(xì)胞系是擴(kuò)大蛋白產(chǎn)量的絕佳策略。“當(dāng)我們出去跟許多人討論時(shí)，很少有人真正需要在蛋白表達(dá)中采用某個(gè)特定的細(xì)胞系。標(biāo)準(zhǔn)的體系往往就是那幾個(gè)， 293 和 CHO ,看起來(lái)適合絕大多數(shù)人的需求。” Chiou 說(shuō)。

    為了迎合這些需求，一些公司提供一系列的 293 和 CHO 細(xì)胞株系，它們尤其適用于大規(guī)模的懸浮培養(yǎng)和蛋白產(chǎn)生。例如，生命技術(shù)公司的Expi 293 系統(tǒng)使用一種特殊的 293 細(xì)胞株和一種專有的培養(yǎng)基去獲得高水平的瞬時(shí)蛋白表達(dá)。該公司稱，Expi 293 每升所產(chǎn)生的蛋白比常規(guī)培養(yǎng)系統(tǒng)要高出 3 到 5 倍。產(chǎn)量升高意味著對(duì)大規(guī)模培養(yǎng)的需求減少。 Chiou 表示，“過(guò)去，如果有人覺(jué)得他們需要擴(kuò)大到5升反應(yīng)才能獲得足夠的蛋白，他們現(xiàn)在可以保持在 1 到 2 升的反應(yīng)規(guī)模。”他接著說(shuō)，“這大大地降低了規(guī)模需求所帶來(lái)的影響。”

    所需的培養(yǎng)規(guī)模即便只增加一點(diǎn)，也常常會(huì)帶來(lái)大量的成本和復(fù)雜性增加，因?yàn)橐?guī)模擴(kuò)大的問(wèn)題往往是非線性的。培養(yǎng)規(guī)模從 1 升增長(zhǎng)到 2 升可能只需要使用大一點(diǎn)的搖瓶，但是從 5 升到 6 升可能意味著購(gòu)置臺(tái)式的生物反應(yīng)器并需要學(xué)習(xí)如何使用它。“轉(zhuǎn)折點(diǎn)一般發(fā)生在你需要改變所使用的容器時(shí)。” Chiou 說(shuō)。

    當(dāng) CHO 和 293 等標(biāo)準(zhǔn)的蛋白表達(dá)細(xì)胞系不起作用時(shí)（可能是需要這些細(xì)胞無(wú)法產(chǎn)生的特殊糖基化模式），一些研究人員轉(zhuǎn)而使用微載體。這種微型的塑料小球?yàn)橘N壁細(xì)胞提供了結(jié)合的基質(zhì)表面。一旦載入，這些微載體和附帶的細(xì)胞就能在搖瓶或旋轉(zhuǎn)瓶中懸浮。這項(xiàng)幾十年前的技術(shù)為很多不能采用其他培養(yǎng)方式的細(xì)胞提供了懸浮培養(yǎng)的諸多便利。微載體最適用于蛋白或病毒的產(chǎn)生，因?yàn)閺奈⑶蛏匣厥栈罴?xì)胞有時(shí)是很棘手的。通用電氣、西格瑪奧德里奇公司和英國(guó)阿克菲爾德的萊伯泰科公司等儀器**商均提供這種微載體。

    多者恒多

    對(duì)于某些細(xì)胞類型和項(xiàng)目而言，現(xiàn)行的懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)都是不可行的。干細(xì)胞尤其如此，很難進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，而疫苗生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)株系 Vero 細(xì)胞也需要緊密地貼在培養(yǎng)皿上。所幸，正在嘗試大批量培養(yǎng)這種緊密貼壁細(xì)胞的科學(xué)家可以從多個(gè)成熟的技術(shù)中進(jìn)行選擇。

    最簡(jiǎn)單的策略是使用內(nèi)部具有多層平板的特殊培養(yǎng)瓶以提高每個(gè)培養(yǎng)瓶的基質(zhì)表面積。這種平行板的方法比懸浮培養(yǎng)稍微麻煩一些，但是儀器制造商已經(jīng)在努力的進(jìn)行優(yōu)化。“我們作為首家公司，數(shù)十年前就與細(xì)胞工廠一起提出這一設(shè)計(jì)，而且我們?cè)谶@個(gè)特定產(chǎn)品線上有豐富的選擇。”位于美國(guó)馬薩諸塞州沃爾瑟姆的賽默飛世爾公司細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用專員 Cindy Neeley 表示。其他公司也提供了貼壁細(xì)胞的分層式生物反應(yīng)器，也經(jīng)常為特定用途進(jìn)行優(yōu)化。例如，位于密蘇里州圣路易斯市的西格瑪奧德里奇公司的 CELLine 生物反應(yīng)器就是專為擴(kuò)大蛋白表達(dá)系統(tǒng)和單克隆抗體生產(chǎn)所設(shè)計(jì)的。

    將細(xì)胞從小的單層培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)到平行層容器也給它們自身帶來(lái)了一系列的挑戰(zhàn)。 Neeley 指出，即使多層培養(yǎng)瓶的所有分層一個(gè)緊挨著一個(gè)，但每層的情況也會(huì)有所不同。“只要超過(guò) 10 層，就會(huì)遇到層間營(yíng)養(yǎng)物分配的問(wèn)題，各層的氣體條件也是如此，這對(duì)我們而言是一大挑戰(zhàn)。” Neeley 說(shuō)。因此，大的平行板系統(tǒng)經(jīng)常配備著特殊的支持設(shè)備。

    在購(gòu)買這種系統(tǒng)時(shí)，研究者也應(yīng)該考慮他們的細(xì)胞目前更需要哪一種基質(zhì)表面。某種細(xì)胞如果已經(jīng)適應(yīng)于貼壁生長(zhǎng)在一種涂層的培養(yǎng)瓶中，當(dāng)轉(zhuǎn)移到一個(gè)具有不同涂層的多層培養(yǎng)瓶時(shí)就可能會(huì)生長(zhǎng)不良。對(duì)于已經(jīng)建立的細(xì)胞系，為了確保涂層是相同的，最簡(jiǎn)單的方式就是在同一個(gè)**小型培養(yǎng)瓶的廠商手中購(gòu)買平行板系統(tǒng)。

    然而，這對(duì)于最前沿的再生醫(yī)學(xué)研究者來(lái)說(shuō)是不起作用的。干細(xì)胞通常過(guò)于挑剔，以至于無(wú)法在市面上現(xiàn)成的通用基質(zhì)表面上生長(zhǎng)，它們需要特殊的涂層試劑，例如 BD 生物科學(xué)公司的 Matrigel 產(chǎn)品。在大型平行板培養(yǎng)瓶上使用這種試劑進(jìn)行涂層不僅比較復(fù)雜，而且價(jià)格高昂。這使得平行板系統(tǒng)離干細(xì)胞的研究工作很遠(yuǎn)，至少目前是這樣。“我們還沒(méi)能做到這一步，但是與我們同樣境地的公司應(yīng)該向這一方向努力，找出……能夠使這些干細(xì)胞附著并生長(zhǎng)的容器。” Neeley 說(shuō)。

    但是對(duì)于能夠在平行板搖瓶中生長(zhǎng)的細(xì)胞而言，隨后的規(guī)模擴(kuò)大（直至工業(yè)化規(guī)模）相對(duì)比較簡(jiǎn)單。事實(shí)上，賽默飛世爾公司最大版本的細(xì)胞工廠在疫苗生產(chǎn)工廠中已經(jīng)司空見(jiàn)慣，工廠中的培養(yǎng)瓶非常大，以至于簡(jiǎn)單地挪動(dòng)位置都是最大的挑戰(zhàn)之一。

    操作多層的大平行板培養(yǎng)瓶存在一定的困難，因此其他設(shè)備研發(fā)者開始創(chuàng)制出更加小巧的系統(tǒng)。位于比利時(shí)布魯塞爾的 ATMI 公司生產(chǎn)的 xPansion 多層生物反應(yīng)器使用更薄的平板，并且與賽默飛世爾的細(xì)胞工廠相比顯得更加緊湊。因此 xPansion 能將相當(dāng)于20個(gè)細(xì)胞工廠的細(xì)胞打包到一個(gè)容器中。除了節(jié)省空間外，更緊湊的系統(tǒng)也減少了培養(yǎng)瓶的數(shù)量，這樣技術(shù)人員在更換培養(yǎng)基或收獲細(xì)胞時(shí)就不用每次處置大量的培養(yǎng)瓶。

    ATMI 公司類似于其他的培養(yǎng)瓶生產(chǎn)者，也在嘗試著給自己的平板做涂層，以使基質(zhì)表面適用于更多外源的細(xì)胞類型。“今天我們只有一種涂層，但是我們實(shí)際上已經(jīng)在（為干細(xì)胞）研究特殊的涂層。” ATMI 公司細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)部主任 Jose Castillo 說(shuō)。

    順其自然

    研究人員在分泌蛋白的表達(dá)系統(tǒng)中使用貼壁細(xì)胞時(shí)，也應(yīng)該考慮另一種規(guī)模擴(kuò)大策略：固定床式生物反應(yīng)器。在該進(jìn)展中，細(xì)胞粘附在小的微球或纖維上，并包覆在一個(gè)大型容器中。介質(zhì)通過(guò)基質(zhì)持續(xù)循環(huán)，為固定床帶來(lái)新鮮的養(yǎng)分與氧氣，同時(shí)排出細(xì)胞廢料及分泌出的蛋白。一旦細(xì)胞被粘附，就很難甚至無(wú)法從固定床中恢復(fù)這些細(xì)胞，但是對(duì)于分泌蛋白產(chǎn)物來(lái)說(shuō)，這點(diǎn)通常不是問(wèn)題。

    固定床系統(tǒng)能夠?qū)⒋罅康馁N壁細(xì)胞維持在相對(duì)較小的體積中。例如 iCells 500 系統(tǒng)能夠在僅為 25 升的體積中做到 500 平方米的貼壁細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)表面積（約為兩個(gè)網(wǎng)球場(chǎng)的面積）。在蛋白表達(dá)和病毒疫苗生產(chǎn)方面，較高的基質(zhì)表面積與體積之比甚至讓固定床系統(tǒng)比懸浮培養(yǎng)更有優(yōu)勢(shì)。 Castillo 說(shuō)，“你將能夠以這種方式優(yōu)化你的灌注過(guò)程，在與攪動(dòng)池生物反應(yīng)器的參考步驟相比時(shí)，（產(chǎn)物）實(shí)際上收集到了更小的體積中。 ”這一點(diǎn)確保 iCells 500 系統(tǒng)適用于實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)化應(yīng)用。

    無(wú)論研究者想要擴(kuò)展哪種細(xì)胞培養(yǎng)類型，由設(shè)備制造商帶來(lái)的最新技術(shù)進(jìn)步已經(jīng)讓規(guī)模擴(kuò)張之路變得相當(dāng)順暢。 Shiloach 解釋，就在過(guò)去的幾年間，“不僅培養(yǎng)基有所進(jìn)步，細(xì)胞系也變好了，所有的分子生物學(xué)研究都具備更加有效的方式。對(duì)我來(lái)說(shuō)，似乎困難在于找到適合的產(chǎn)品，而不是去制造產(chǎn)品。”