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    傳統(tǒng)觀念認為膿毒癥（sepsis）是一種失控的、持久性全身炎癥反應。目前，人們漸漸認識到，在膿毒癥的發(fā)病過程中機體并非處于一成不變的免疫激活狀態(tài)，負向調控（negative regulation）機制在膿毒癥的發(fā)生與發(fā)展中也發(fā)揮著重要作用。機體在免疫應答正?；驔]有外界急性損害的情況下，正向與負向調控處于平衡狀態(tài)并維持各項生命活動的正常運行。但嚴重創(chuàng)傷、休克及膿毒癥時機體不僅出現(xiàn)過度的炎癥反應，而且存在著嚴重細胞免疫功能低下，表現(xiàn)為淋巴細胞大量凋亡和免疫無反應性，這與免疫負向調控效應密切相關[1, 2]。機體免疫功能障礙的原因是多方面的，不論是抑制性免疫細胞、細胞因子還是信號轉導通路的變化均系負向調控發(fā)揮作用的重要途徑，深入了解負向調控在膿毒癥中的作用及意義，在關鍵環(huán)節(jié)進行精確干預將有助于恢復機體正常的免疫應答狀態(tài)、防止嚴重感染并發(fā)癥的發(fā)生與發(fā)展。

    1 中樞神經(jīng)系統(tǒng)調控外周免疫反應的負向神經(jīng)信號途徑

    中樞神經(jīng)系統(tǒng)調控外周免疫反應的神經(jīng)信號通路主要包括下丘腦-垂體-腎上腺軸、交感神經(jīng)系統(tǒng)和副交感神經(jīng)系統(tǒng)等。當機體受到感染等外來打擊時，可迅速產(chǎn)生應激，調動機體內部各系統(tǒng)發(fā)生變化，以維護內環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，確保生長、再生與修復等基本生理功能正常。其中下丘腦-垂體-腎上腺軸及交感神經(jīng)系統(tǒng)是機體應激反應中重要的“指揮者”與“執(zhí)行者”；與此同時，副交感神經(jīng)系統(tǒng)的植物神經(jīng)功能受到抑制。我們初步的研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)內分泌激素對創(chuàng)（燒）傷后免疫功能及感染的反應性具有重要調節(jié)作用。嚴重創(chuàng)傷、燒傷和感染病理過程中，自主神經(jīng)系統(tǒng)以及下丘腦-垂體-腎上腺軸的激活使應激激素濃度增加，造成免疫麻痹、高代謝和心血管功能異常等；如不及時糾正，會出現(xiàn)惡病質和進行性器官功能障礙，甚至死亡。由此可見，神經(jīng)-內分泌-免疫系統(tǒng)功能失調是膿毒癥常見的病理生理反應，弄清其確切發(fā)病機制無疑具有重要臨床意義。新近的臨床觀察表明，針對神經(jīng)-內分泌-免疫功能失調致病環(huán)節(jié)進行有效干預，可能是防止嚴重膿毒癥及多器官功能障礙綜合征（MODS）的根本途徑之一[3]。

    既往許多研究主要關注下丘腦-垂體-腎上腺軸和交感神經(jīng)系統(tǒng)對外周炎癥免疫的調控，但有資料提示β腎上腺素能阻斷劑并不能完全調節(jié)外周自主神經(jīng)系統(tǒng)平衡，故對神經(jīng)系統(tǒng)負向調控的研究日益受到重視，尤其是副交感神經(jīng)通路（主要通過迷走神經(jīng)）。迷走神經(jīng)是自主神經(jīng)系統(tǒng)的周圍部分之一，其節(jié)前神經(jīng)元位于腦干及脊髓灰質內，節(jié)后神經(jīng)元分散在效應器附近，節(jié)前后纖維均為膽堿能神經(jīng)纖維（包括傳入和傳出纖維），迷走神經(jīng)的主要遞質是乙酰膽堿。據(jù)報道，神經(jīng)系統(tǒng)通過迷走神經(jīng)能夠顯著、快速地抑制巨噬細胞腫瘤壞死因子（TNF）-α和高遷移率族蛋白B1（high mobility group box-1 protein, HMGB1）的釋放，減輕全身性炎癥反應。這一生理機制稱作“膽堿能抗炎通路”，通過抑制促炎細胞因子的合成反饋地監(jiān)控和調節(jié)炎癥過程，該效應主要依賴于細胞上煙堿型乙酰膽堿受體α7亞單位（α7 nicotinic acetylcholine receptor, α7 nAChR） [4]。研究證實，α7 nAChR廣泛表達于炎性細胞和免疫細胞，包括T淋巴細胞、樹突狀細胞（DC）等；我們新近發(fā)現(xiàn)，CD4+CD25+調節(jié)性T細胞（Treg）表面也存在此受體，適當濃度煙堿刺激Treg可上調其主要表面分子T淋巴細胞毒性相關抗原（CTLA）-4和叉頭翼狀螺旋轉錄因子（Foxp3）表達，最終增強Treg介導的T淋巴細胞免疫抑制活性；而α7 nAChR特異性拮抗劑能逆轉煙堿的上述效應，表明α7 nAChR是介導Treg抑制效應的受體之一[5]。此外，膽堿能抗炎通路可通過阻止T淋巴細胞的分化和成熟、抑制中性粒細胞及單核細胞的殺傷功能發(fā)揮免疫調節(jié)效應。與已經(jīng)確認的體液調節(jié)途徑相比，膽堿能炎癥反射調節(jié)途徑具有快速、局部化和綜合性的特點。迷走神經(jīng)傳出信號為神經(jīng)調節(jié)免疫反應提供了直接通路，同時展示了新的概念：神經(jīng)-免疫軸通過神經(jīng)調節(jié)免疫應答，進而控制炎癥反應，自主神經(jīng)系統(tǒng)在大腦與免疫系統(tǒng)之間的雙向通訊中發(fā)揮了中樞監(jiān)控免疫狀態(tài)、控制炎癥反應的作用[6]。

    2 膿毒癥病理過程中外周細胞免疫反應的負向調控作用

    在機體的負向調控途徑中，不同免疫細胞亞群發(fā)揮著重要調節(jié)作用，其中Treg日益受到高度關注。Treg作為一類具有免疫調節(jié)功能的成熟T細胞亞群，不僅在免疫自穩(wěn)、移植耐受、腫瘤免疫、過敏反應等方面具有重要意義，而且在感染免疫方面也可通過對細胞免疫抑制發(fā)揮核心調節(jié)作用[7, 8]。Treg的種類較多，一般依據(jù)其發(fā)育、特異性及作用機制多分為天然Treg和獲得性Treg。天然Treg主要由胸腺發(fā)育成熟后進入外周淋巴組織，目前了解較多的是CD4+CD25+ Treg；獲得性Treg是成熟T細胞（CD4+CD25- T細胞）在外周淋巴組織中接觸特異性抗原或在免疫抑制因子如白介素（IL）-10、轉化生長因子（TGF）-β的作用下活化而誘導產(chǎn)生。業(yè)已明確，Treg的免疫調節(jié)表現(xiàn)為免疫抑制性與免疫無能性，其對效應性T細胞的抑制反應主要通過細胞接觸機制和細胞因子分泌方式起作用。Treg抑制機制的發(fā)揮涉及多個膜表面分子、細胞因子和其他可溶性因子的作用，其中TGF-β與IL-10作為主要抑制性細胞因子可介導其抑制功能的發(fā)揮，F(xiàn)oxp3則特異地表達于CD4+CD25+ Treg，其基因改變所致轉錄因子的功能異常直接影響Treg表型及活性的發(fā)揮。此外，IL-35是一種最近新發(fā)現(xiàn)的抑制性細胞因子，它可由CD4+CD25+ Treg特異性產(chǎn)生，是Treg發(fā)揮抑制作用所必須的細胞因子[9]。

    我們的資料證實，嚴重燙傷可使大鼠脾臟CD4+CD25+ Treg表面分子CTLA-4和Foxp3表達明顯增強，并促進其免疫抑制功能成熟。與此同時，燙傷后脾組織CD4+CD25+ Treg分泌IL-10水平與假燙傷組比較也顯著升高[10]。臨床試驗結果顯示，燒傷后并發(fā)膿毒癥患者Treg表面CTLA-4及Foxp3表達顯著高于無膿毒癥患者，膿毒癥死亡組其表達亦顯著高于存活組。由此可見，嚴重燒傷可促進外周血CD4+CD25+ Treg免疫抑制功能成熟，并刺激其分泌大量抑制性細胞因子發(fā)揮負向調節(jié)作用，從而導致機體細胞免疫功能低下甚至免疫紊亂的發(fā)生[10, 11]。那么是什么因素促進了嚴重損傷后CD4+CD25+ Treg免疫抑制功能成熟呢？我們初步實驗提示，HMGB1可作為一種免疫調節(jié)因子，在外周參與調控Treg和T淋巴細胞免疫功能狀態(tài)。實驗結果表明：燙傷后HMGB1的持續(xù)升高可刺激Treg向成熟發(fā)展，從而介導T淋巴細胞增殖反應低下，并向輔助性T細胞（Th） 2漂移，免疫功能受抑；HMGB1介導的Treg功能成熟還可通過下調T淋巴細胞核因子（NF）-κB活性而減少IL-2基因表達和蛋白合成，進而影響T淋巴細胞的增殖反應活性[10]。在此基礎上，我們觀察了HMGB1攻擊后不同基因型小鼠CD4+CD25+ Treg免疫功能的改變及其受體作用機制。給C3H/HeN和C3H/HeJ [分別為Toll樣受體4野生型（TLR4+/+）和天然突變型（TLR4-/-）] 小鼠腹腔注射不同劑量HMGB1，發(fā)現(xiàn)C3H/HeN小鼠CD4+CD25+ Treg表達CTLA-4水平顯著下降，同時生成IL-10量也明顯降低；但不同劑量HMGB1攻擊可引起C3H/HeJ小鼠CD4+CD25+ Treg表達CTLA-4明顯上調和生成IL-10量增加。提示TLR4在HMGB1誘導CD4+CD25+ Treg免疫活性過程中發(fā)揮了重要負向調控作用[12]。

    3 膿毒癥時參與免疫負向調節(jié)的新蛋白分子

    在急性損傷或膿毒癥過程中，一些免疫負調控分子發(fā)揮著重要作用。TNF-α誘導蛋白-8樣分子2 （tumor necrosis factor-α induced protein 8 like-2, TIPE2） 是一個新發(fā)現(xiàn)的蛋白分子，主要選擇性表達于淋巴源性和髓源性細胞。TIPE2是維持宿主免疫穩(wěn)態(tài)所必需的，主要通過對T細胞受體和Toll樣受體（TLRs）信號途徑實行負向調控，進而調節(jié)機體天然/獲得性免疫應答過程[13, 14]。有資料證實，小鼠TIPE2基因主要表達于胸腺、脾臟、淋巴結以及小腸粘膜等免疫器官或組織中，而在肝臟、心臟、肌肉、睪丸以及正常鼠的神經(jīng)系統(tǒng)均無表達，但在實驗性自身免疫腦脊髓炎動物模型呈高表達。而TIPE2基因敲除小鼠體內細胞免疫應答反應嚴重受損，TIPE2基因缺失的T細胞培養(yǎng)上清Th1型細胞因子干擾素（IFN）-γ、Th2型細胞因子IL-4均呈不同程度的增加。進一步觀察證實，TIPE2與前凋亡caspase-8存在聯(lián)系，可能通過前凋亡酶調節(jié)NF-κB通路。TIPE2能下調激活蛋白-1和 NF-κB的活化，TIPE2基因缺陷細胞呈現(xiàn)對TLR和T細胞受體信號活化的高反應性。此外，與正常野生型相比，TIPE2基因敲除動物出現(xiàn)明顯膿毒性休克反應，TIPE2基因表達下調引起持續(xù)性淋巴細胞活化，可導致Fas表達增強并促進淋巴細胞凋亡[13]。

    我們采用共聚焦熒光法對CD4+CD25+ Treg細胞內TIPE2的分布進行初步定位，并從基因和蛋白水平檢測到Treg 細胞內TIPE2表達。結果顯示，CD4+CD25+ Treg細胞胞漿中高表達TIPE2，蛋白印跡證實Treg細胞中存在清晰的TIPE2條帶，同時檢測到147 bp大小的特異性TIPE2目的基因條帶。證明TIPE2在小鼠CD4+CD25+ Treg細胞內存在表達。通過采用小RNA干擾技術（siRNA）沉默TIPE2表達，我們進一步分析TIPE2對CD4+CD25+ Treg免疫抑制活性的影響，觀察到刺激活化的CD4+CD25+ Treg細胞CTLA-4和Foxp3表達明顯下降，同時IL-10和TGF-β生成量顯著減少；此外，CD4+CD25+ Treg對效應T細胞的抑制功能明顯減弱。說明TIPE2作為一種重要的負向調控分子，在CD4+CD25+ Treg細胞中表達并影響CD4+CD25+ Treg的免疫抑制功能[15]。

    4 研究展望

    綜上所述，負向調節(jié)途徑在膿毒癥復雜的炎癥免疫調控網(wǎng)絡中具有重要作用及意義。目前，膿毒癥確切發(fā)病機制、早期診斷與防止策略仍然是現(xiàn)代創(chuàng)（燒）傷外科和危重病醫(yī)學亟待解決的重大難題。對創(chuàng)（燒）傷后機體免疫功能平衡狀況與動態(tài)變化的了解尚缺乏客觀準確的指標和評估體系，中樞和外周器官中免疫負向調節(jié)細胞、受體、分子及其信號通路改變能否為膿毒癥的早期識別、病程監(jiān)測、預后評估提供有價值信息尚有待進一步探討。負向調控途徑在膿毒癥免疫功能紊亂中的確切臨床意義如何？對疾病的轉歸發(fā)揮怎樣的調節(jié)效應？通過何種途徑實現(xiàn)對機體免疫反應的平衡調節(jié)等諸多關鍵問題均有待深入研究。