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    國(guó)內(nèi)外臨床試驗(yàn)研究

    胎兒染色體非整倍體異常的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)（NIPT）得益于新一代高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，國(guó)內(nèi)外研究人員進(jìn)行了大量的臨床試驗(yàn)進(jìn)一步探討該技術(shù)在產(chǎn)前檢測(cè)中的應(yīng)用。

    2008年有兩個(gè)不同的海外研究小組（Chiu等人。 2008; Fan等人。 2008）采用大規(guī)模平行測(cè)序技術(shù)（MPS）在妊娠21三體綜合征胎兒的孕婦的外周血中發(fā)現(xiàn)了超量的21號(hào)染色體。隨后，又相繼發(fā)表三個(gè)臨床試驗(yàn)，再次驗(yàn)證了大規(guī)模平行測(cè)序（MPS）對(duì)染色體非整倍體的檢出具有高靈敏度和特異性（見表1）。于是，從2011年年底開始，美國(guó)產(chǎn)前臨床界開始利用NIPT對(duì)高危孕婦進(jìn)行檢測(cè)。Palomaki等人（2011）的研究驗(yàn)證了MPS對(duì)高危妊娠母體血漿胎兒T21的檢測(cè)擁有近99%的靈敏度和特異性，這里定義高危妊娠因素包括產(chǎn)婦年齡、家族病史，血清學(xué)篩查高危和超聲篩查高危。隨后該小組（Palomaki等，2012），又發(fā)表一項(xiàng)研究顯示MPS對(duì)T18檢測(cè)的靈敏度為100%,假陽性率為0.28%,對(duì)T13檢測(cè)的靈敏度為91.7%,假陽性率為0.97%.針對(duì)T13、T18和T21檢測(cè)的復(fù)合靈敏度為98.9%,復(fù)合假陽性率為1.4%.Bianchi等人（2012）也采用MPS對(duì)高危妊娠孕婦的血清進(jìn)行檢測(cè)，但算法分析稍有不同。在這項(xiàng)研究中，NIPT針對(duì)T21、T18和T13檢測(cè)的靈敏度分別為100%、97.2%、78.6%;特異性皆為100%.他們還報(bào)道了NIPT也能檢測(cè)出其他染色體非整倍體，也包括易位型三體以及嵌合型三體。特別是，對(duì)X染色體單體檢測(cè)的靈敏度為93.8%,特異性為99.8%.此外，Bianchi等人同時(shí)認(rèn)為NIPT在不久的將來也可對(duì)其他染色體異常進(jìn)行篩查。Mazloom等人很快就進(jìn)一步證實(shí)了這一觀點(diǎn)，他們?cè)诨贛PS技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過構(gòu)建針對(duì)性染色體的分類算法，對(duì)包括[47,XXX], [45,X], [47,XXY], and [47,XYY]在內(nèi)的幾大性染色體綜合征進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果的復(fù)合靈敏度為96.2%,特異性為0.3%.這一結(jié)果提示無創(chuàng)檢測(cè)技術(shù)對(duì)特納綜合征、XYY、克氏綜合癥的檢測(cè)精確度接近常染色體，可以考慮將其應(yīng)用于臨床。

    另外一些研究人員采用選擇性的染色體分析方法。該方法是對(duì)母體血漿游離DNA的特定的染色體區(qū)域進(jìn)行測(cè)序（Sparks等人，2012）。最近發(fā)表了一項(xiàng)多中心合作的臨床研究，針對(duì)接受CVS或羊水穿刺術(shù)的孕婦人群，采用染色體選擇性的測(cè)序方法對(duì)T21和T18進(jìn)行檢測(cè)。（Norton等，2012）（見表1）。利用選定區(qū)域數(shù)字化分析（DANSR）方法以及FORTE算法進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，預(yù)設(shè)cut-off值為1%進(jìn)行高風(fēng)險(xiǎn)與低風(fēng)險(xiǎn)的界定。結(jié)果顯示對(duì)T21檢出的靈敏度和特異性分別為100%和99.97%. T18的靈敏度和特異性分別為97.4%和99.93%.隨后又發(fā)表的一篇文章（Ashoor等人，2012）表明使用DANSR和FORTE方法在一項(xiàng)回顧性的病例對(duì)照研究中，對(duì)T13檢測(cè)的靈敏度和特異性分別為80%和99.95%.Zimmermann（2012）通過對(duì)166例樣本的染色體多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行選擇性的測(cè)序分析，并使用MATLAB （MathWorks, Natick, MA, USA） 實(shí)驗(yàn)室提供統(tǒng)的計(jì)算方法對(duì)染色體拷貝數(shù)進(jìn)行分類計(jì)算，其復(fù)合計(jì)算精度達(dá)到了99.8%,除一例45X因DNA質(zhì)量問題沒能檢測(cè)到，其余的19例染色體非整倍體達(dá)到了100%的靈敏度和特異性。

    這些研究證實(shí)NIPT在高風(fēng)險(xiǎn)孕婦人群中，針對(duì)T21、T13、T18的檢測(cè)是一種可靠的方法。

    同樣針對(duì)該項(xiàng)技術(shù)，國(guó)內(nèi)也進(jìn)行了兩期大規(guī)模臨床試驗(yàn)。梁德生等人（2013）的一項(xiàng)412份有效樣本的回顧性臨床試驗(yàn)，針對(duì)唐氏綜合征高危孕婦采用MPS進(jìn)行NIPT檢測(cè)，結(jié)果顯示對(duì)T21、T18、T13復(fù)合檢測(cè)靈敏度為100%,復(fù)合檢測(cè)特異性高于99.7%.同時(shí)，結(jié)果也印證了通過一次檢測(cè)可同時(shí)對(duì)全部染色體非整倍體進(jìn)行觀察。另外一項(xiàng)更大規(guī)模的前瞻性的臨床試驗(yàn)收集了超過2000份孕婦血漿（宋義軍等，2013），同樣采用MPS對(duì)T21、T18、T13進(jìn)行檢測(cè)，檢出率為100%,假陽性率為0.05%.這項(xiàng)研究中低于35歲的非高齡孕婦都有血清學(xué)篩查結(jié)果作為對(duì)照，不僅證實(shí)NIPT擁有遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)血清學(xué)篩查的靈敏度和特異性，更進(jìn)一步驗(yàn)證NIPT未來在中等風(fēng)險(xiǎn)及低風(fēng)險(xiǎn)孕婦人群的應(yīng)用。來自**的一項(xiàng)多中心合作研究顯示（Shaw等，2013），在100例極高危孕婦群體中，除一例45X由于DNA含量不足未能識(shí)別外，其余染色體非整倍體全部檢出，復(fù)合檢出率出為96.4%,而對(duì)低危組群的201例樣本未發(fā)現(xiàn)染色體異常，結(jié)果證實(shí)特異性為100%.

    不謀而和的是，國(guó)際研究也表明NIPT在中等風(fēng)險(xiǎn)人群中應(yīng)該具有類似的靈敏度和特異性（Nicolaides等人，2012），這預(yù)示著隨著越來越多臨床數(shù)據(jù)的積累，未來NIPT可以覆蓋到中等風(fēng)險(xiǎn)孕婦人群（Norton等，2012）。

    隨著NIPT 在臨床的大規(guī)模實(shí)踐，科學(xué)小組展開了越來越多細(xì)致深入的研究，F(xiàn)utch（2013年）等人最近總結(jié)了2012年2月-7月間5974例臨床樣本的檢測(cè)結(jié)果（見表1），并對(duì)可能影響檢測(cè)結(jié)果的生物相關(guān)因素做了討論，研究認(rèn)為，胎盤嵌合，母體的惡性腫瘤，母親嵌合體，雙胞胎中一胎停育等情況都應(yīng)考慮到基因組測(cè)序的過程當(dāng)中，并建立起一套無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)的臨床性能參數(shù)。此外，孕周和DNA在母血中的百分含量也是影響檢測(cè)結(jié)果的重要因素，Wang等人（2013）對(duì)22,384份樣本分析發(fā)現(xiàn)，母血漿中胎兒DNA含量與孕婦體重成反比，與孕周成正比，在10-21孕周間，胎兒DNA含量每周增加0.1%,超過21孕周時(shí)，DNA含量每周增加1%.在初次采血DNA含量不足的情況下，平均3.6周后再次采血，DNA含量有普遍提高。

    隨著無創(chuàng)檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，人們逐漸在嘗試通過MPS方法對(duì)染色體結(jié)構(gòu)異常進(jìn)行檢測(cè)，Srinivasan（2013）對(duì)11個(gè)經(jīng)過核型診斷的胎兒游離DNA進(jìn)行了分析。對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行了大約109個(gè)25堿基目標(biāo)片段的測(cè)序分析。通過靶序列計(jì)算和歸一化處理，除四例嵌合體外，MPS發(fā)現(xiàn)了全部的7個(gè)缺失、重復(fù)、易位和20號(hào)染色體三體。其結(jié)果甚至好于核型分析。近期的報(bào)道也認(rèn)為（Lau,2013），通過生物信息學(xué)方法的不斷改進(jìn)，基于MPS方法對(duì)胎兒染色體結(jié)構(gòu)異常進(jìn)行檢測(cè)具有可行性。可以預(yù)見，無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)在不久的將來會(huì)有更為廣泛的臨床用途。

    國(guó)內(nèi)外指導(dǎo)意見/專家共識(shí)

    雖然國(guó)內(nèi)外臨床研究已十分廣泛的開展，但迄今為止，專業(yè)協(xié)會(huì)共識(shí)或關(guān)于NIPT的指導(dǎo)意見還為數(shù)不多。2012年ISPD發(fā)表聲明，在恰當(dāng)?shù)倪z傳咨詢引導(dǎo)下，通過其他篩查方法、母親年齡或家族病史確定為高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦，可以進(jìn)行NIPT（benn等。2012A）。同年美國(guó)婦產(chǎn)科學(xué)會(huì)（ACOG）與美國(guó)母胎醫(yī)學(xué)會(huì)（SMFM）也共同發(fā)表委員會(huì)指導(dǎo)意見，推薦無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(cè)作為非整倍體高危人群的一種初篩檢測(cè)。學(xué)會(huì)同時(shí)詳細(xì)界定了非整倍體高危人群：1）母親年齡超過35歲；2）超聲結(jié)果顯示非整倍體高危；3）生育過三體患兒；4）早孕期，中孕期或三聯(lián)篩查、四聯(lián)篩查呈現(xiàn)非整倍體陽性結(jié)果；5）父母為羅伯遜易位。

    面對(duì)NIPT迅猛發(fā)展帶給臨床遺傳咨詢的種種問題，2013年1月美國(guó)國(guó)家遺傳咨詢師協(xié)會(huì)（NSGC）針對(duì)無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(cè)的遺傳咨詢發(fā)表指導(dǎo)意見。NSGC認(rèn)為1）NIPT當(dāng)前只作為產(chǎn)前染色體非整倍體評(píng)估的補(bǔ)充檢測(cè)，其結(jié)果不能視為診斷，異常結(jié)果必須通過有創(chuàng)性診斷確診；2）因缺乏在中低風(fēng)險(xiǎn)人群中的臨床數(shù)據(jù)NIPT暫時(shí)不能替代現(xiàn)有的染色體非整體篩查方法；3）現(xiàn)有的臨床數(shù)據(jù)顯示NIPT只能涵蓋T21、T18、T13等，所以在孕婦檢測(cè)之前應(yīng)對(duì)其說明這項(xiàng)檢測(cè)的檢測(cè)范圍和局限性；4）需重視檢測(cè)前和檢測(cè)后的遺傳咨詢，并給出正確的咨詢意見；5）如果超聲檢查異常、家族有染色體異常病史、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、高齡、篩查陽性等，無論其NIPT結(jié)果如何，都應(yīng)對(duì)其進(jìn)行詳細(xì)的遺傳咨詢；6）NIPT發(fā)展迅速，臨床試驗(yàn)如火如荼，NSGC也將根據(jù)NIPT的發(fā)展調(diào)整遺傳咨詢的指導(dǎo)意見。

    2013年4月，ISPD再次發(fā)表指導(dǎo)意見（Benn等，2013），在此前的基礎(chǔ)上結(jié)合最新的進(jìn)展與出現(xiàn)的問題，提出一些新觀點(diǎn)。NIPT對(duì)性染色體的篩查率較低；當(dāng)發(fā)生雙胎一胎早期流產(chǎn)時(shí)，結(jié)果將不準(zhǔn)確；對(duì)于嵌合體（包括局限性胎盤嵌合體），結(jié)果將不準(zhǔn)確。

    緊接著同年4月，美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)及基因組學(xué)學(xué)會(huì)（ACMG）在肯定NIPT極高的準(zhǔn)確率和較低的假陽性率的同時(shí)，也針對(duì)NIPT的局限性、遺傳咨詢及臨床標(biāo)準(zhǔn)發(fā)表聲明。

    國(guó)內(nèi)衛(wèi)計(jì)委全國(guó)產(chǎn)前診斷技術(shù)專家組也于2012年就無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行了論證（邊旭明等人、2012），指出該檢測(cè)技術(shù)是一種"近似于診斷水平"、"目標(biāo)疾病指向精確"的產(chǎn)前檢篩查新技術(shù)，應(yīng)該與現(xiàn)行的產(chǎn)前篩查體系相結(jié)合，并準(zhǔn)確把握臨床適用人群，包括1）有介入性產(chǎn)前診斷禁忌癥者（先兆流產(chǎn)、發(fā)熱、有出血傾向、感染未愈等）；2） 產(chǎn)前篩查高?；蚺R界高危孕婦（如風(fēng)險(xiǎn)率在1/270-1/1000）；3） 珍貴兒，知情后拒絕介入性產(chǎn)前診斷的孕婦；4）對(duì)介入性產(chǎn)前診斷極度焦慮的孕婦；5）就診時(shí)處于較大孕周超出目前產(chǎn)前篩查范圍的孕婦。