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掌握植物總RNA非變性膠電泳的原理和方法。

    二、實(shí)驗(yàn)原理

    RNA電泳可以在變性及非變性兩種條件下進(jìn)行。非變性電泳使用1.0%--1.4%的凝膠，不同的RNA條帶也能分開(kāi)，但無(wú)法判斷其分子量。只有在完全變性的條件下，RNA的泳動(dòng)率才與分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系。因此要測(cè)定RNA分子量時(shí)，一定要用變性凝膠。在需快速檢測(cè)所提總RNA樣品完整性時(shí)，配制普通的1%瓊脂糖凝膠即可。

    三、實(shí)驗(yàn)材料、器具及藥品

    蘑菇的總RNA溶液。 電泳儀，電泳槽，電子天平，移液器，槍頭，微波爐，紫外透射檢測(cè)儀等。 瓊脂糖，1XTAE電泳緩沖液，0.5μg/ml溴化乙錠(EB)10X載樣緩沖液。

    四、實(shí)驗(yàn)步驟

    (1)用1×TAE電泳緩沖液制作瓊脂糖凝膠，加1×TAE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠。

    (2)在超凈工作臺(tái)上，用移液器吸取總RNA樣品4μl于封口膜上。在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上再加入5μl 1×TAE電泳緩沖液及1μl 的10X載樣緩沖液，混勻后，小心加入點(diǎn)樣孔。

    (3)打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至100V，使RNA由負(fù)極向正極電泳，約30min后將凝膠放入EB染液中染色5min,用清水稍微漂洗。在紫外透射檢測(cè)儀上觀察RNA電泳結(jié)果。

    試劑：

    (1)MOPS緩沖液(10*):0.4mol/L 嗎啉代丙烷磺酸(MOPS) (Ph7.0)，0.1mol/L NaAc, 10mol/L EDTA。

    (2)上樣染料：50%甘油，1mmol/L EDTA ,0.4%溴酚藍(lán)，0.4%二甲苯藍(lán)。

    (3)甲醛。

    (4)去離子甲酰胺。v電泳槽清洗：去污劑洗趕緊(一般浸泡過(guò)夜)——水沖洗——乙醇干燥——3%H2O2灌滿——室溫放置10分鐘——0.1%DEPC水沖洗。

    操作：

    (1) 將制膠用具用70%乙醇沖洗一遍，晾干備用。

    (2) 配制瓊脂糖凝膠。

    ①稱取0.5g瓊脂糖，置趕緊的100ml 錐形瓶中，加入40ml蒸餾水，微波爐內(nèi)加熱使瓊脂糖徹底溶化均勻。

    ②待膠涼至60--70 ℃，依次向其中加入9ml 甲醛、5ml 10X MOPS緩沖液和0.5ul 溴化乙錠，混合均勻。

    ③灌制瓊脂糖凝膠。

    (3) 樣品準(zhǔn)備：

    ① 取 DEPC處理過(guò)的500ul小離心管，依次加入如下試劑： 10x MOPS緩沖液2ul，甲醛3.5ul,甲酰胺(去離子)10ul，RNA 樣品 4.5ul,混勻。

    ② 將離心管置于60℃水浴中保10分鐘，再置冰上2分鐘。

    ③ 向管中加入3ul 上樣染料，混勻。

    (4)上樣。

    (5)電泳：電泳槽內(nèi)加入1XMOPS緩沖液，于7.5V/ml 的電壓下電泳。

    (6)電泳結(jié)束后，在紫外燈下檢查結(jié)果。

    小結(jié)：RNA瓊脂糖凝膠電泳中務(wù)必去除RNASE酶的污染，所有的試劑需用DEPC水配制，所用的器材也要的DEPC處理并滅菌，防止RNA被降解。