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    作者：江西中醫(yī)藥大學藥學院 周年

    正常骨組織處于一種以破骨細胞吸收骨組織和成骨細胞形成骨組織相協(xié)調(diào)的不斷重建的動態(tài)平衡過程。激素、脂氧化物、生長因子以及炎癥細胞因子等可影響成骨細胞和破骨細胞的活化、分化、增殖和成熟而改變骨重建過程，打破骨吸收和骨形成間的平衡產(chǎn)生骨質(zhì)疏松癥。據(jù)報道到2025年，僅美國因骨質(zhì)疏松癥引起的骨折發(fā)生率就將高達每年300萬例，因此骨質(zhì)疏松癥已成為影響人們生活質(zhì)量的流行病之一。雌激素缺乏一度被認為是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的主要原因，然而補充雌激素骨質(zhì)疏松癥并未得到明顯改善。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)ROS可能是骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的主要根源，其誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激在骨質(zhì)疏松癥中發(fā)揮重要作用。因此骨質(zhì)疏松癥的治療焦點開始從“以雌激素為中心”轉(zhuǎn)向“以氧化應(yīng)激為中心”.

    氧化應(yīng)激的產(chǎn)生

    ROS主要是細胞線粒體在傳遞電子提供能量過程中產(chǎn)生，如超氧負離子（O2-）、羥自由基（OH-）和過氧化氫（H2O2）等。當然，在應(yīng)對細胞外界**如生長因子等時，通過煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（Nox1）、環(huán)氧合酶及脂氧合酶等也可產(chǎn)生ROS.同時，機體還存在一套抵御ROS的防衛(wèi)系統(tǒng)，兩者間保持動態(tài)平衡。這一系統(tǒng)包括酶及轉(zhuǎn)錄因子依賴的抗氧化酶系統(tǒng)以及細胞自身存在的自噬作用，前者主要是超氧化物歧化酶、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶、叉形頭轉(zhuǎn)錄因子O亞型（FoxO）轉(zhuǎn)錄引起的抗氧化酶基因等的表達。

    ROS可激活c-Jun氨基端激酶（JNK）通路使FoxO轉(zhuǎn)錄因子磷酸化，并從胞漿釋入胞核，激活核上FoxO介導(dǎo)的抗氧化酶如錳超氧化物歧化酶（MnSOD）、CAT基因的表達，延長細胞靜息期，從而保護靜息細胞不受氧化損傷。然而過多的ROS激活FoxO轉(zhuǎn)錄還可削弱有限的β-連環(huán)蛋白（β-catenin）向T細胞轉(zhuǎn)換因子/淋巴增強因子（TCF/LEF）轉(zhuǎn)錄，降低成骨細胞生成。

    因此在正常情況僅依靠前者不足以**由于ROS導(dǎo)致的細胞內(nèi)損傷，后者即為通過泛素蛋白酶體或溶酶體途徑修復(fù)或移除因細胞內(nèi)過多ROS引起的功能異常的細胞器和蛋白質(zhì)，以保證細胞健康的進一步防衛(wèi)。通過其自噬作用可降解損傷的線粒體，打破損傷線粒體再次產(chǎn)生過多ROS的惡性循環(huán)，一定程度上維護骨形成和骨吸收間的平衡。機體由于衰老、疾病等原因后線粒體損傷加劇，而防衛(wèi)機制減弱，使得ROS產(chǎn)生與ROS清除間的平衡被打破，氧化應(yīng)激隨即產(chǎn)生。

    通常，在氧化應(yīng)激條件下，線粒體內(nèi)膜釋放出一種可調(diào)節(jié)蛋白p66shc,在傳遞電子過程中作為氧化還原酶將O2還原為H2O2,后者對誘導(dǎo)成骨細胞凋亡起到相當關(guān)鍵的信號作用。ROS通過對多種細胞因子、酶活性的激活或抑制和上調(diào)或下調(diào)受體配體的表達調(diào)控多條信號通路，最終影響核內(nèi)基因表達，促進BMSCs、成骨細胞、骨細胞的凋亡和破骨細胞的增殖及分化，使得骨形成速率相對骨吸收速率滯后，導(dǎo)致骨重建平衡被打破。

    氧化應(yīng)激對骨質(zhì)疏松癥的影響

    氧化應(yīng)激對骨形成相關(guān)細胞的影響

    氧化應(yīng)激對BMSCs的影響：BMSCs具有多向分化的趨勢，其向成骨細胞分化同時還可向脂肪細胞和軟骨細胞分化。經(jīng)典Wnt/β-catenin通路在BMSCs定向分化中起到相當重要的作用，其主要過抑制過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）的表達，阻止BMSCs向脂肪細胞和軟骨細胞分化。

    研究表明：去除成人老鼠前成骨細胞β-catenin后可引起PPARγ表達增加，骨量減少及骨髓脂肪化。機體由于衰老產(chǎn)生氧化應(yīng)激后，過多的ROS不僅使得BMSCs向成骨細胞分化能力降低，同時還削弱其增殖能力，延長其靜息期，導(dǎo)致成骨細胞生成減少。據(jù)報道源于老年鼠的BMSCs與年輕鼠相比，胞內(nèi)呈現(xiàn)出高水平的脂氧化物及低活力的抗氧化酶。此外，源于早年衰老綜合癥病人的BMSCs顯現(xiàn)出其分化能力的缺陷。

    ROS影響B(tài)MSCs的增殖和定向分化主要是通過氧化不飽和脂肪酸（PUFAs）激活ROS/FoxO/PPARγ/β-catenin通路而實現(xiàn)的，其使得胞內(nèi)脂氧合酶花生四烯酸15表達增加，后者氧化PUFAs產(chǎn)生脂氧化物，激活PPARγ表達并產(chǎn)生一種促氧化劑4-羥基壬烯醛繼而產(chǎn)生更多的ROS.過多的ROS通過激活FoxO轉(zhuǎn)錄和ROS作用產(chǎn)物脂氧化物通過激活PPARγ表達，兩者共同削弱Wnt/-catenin向TCF/LEF轉(zhuǎn)錄。由此可見，ROS通過氧化PUFAs激活ROS/FoxO/PPARγ/β-catenin通路削弱BMSCs向成骨細胞定向分化并抑制其增殖能力，減少成骨細胞生成，從而影響骨形成作用。

    氧化應(yīng)激對成骨細胞的影響：成骨細胞由BMSCs分化而來，是骨形成的功能細胞。Wnt/β-catenin通路促進BMSCs定向分化為成骨細胞的同時還可加快成熟成骨細胞礦化和骨基質(zhì)形成速率。穩(wěn)定表達的β-catenin進入核內(nèi)與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合啟動早期成骨細胞分化標志基因Runx2表達，后者可調(diào)控成骨細胞的特異性基因如堿性磷酸酶、骨鈣蛋白、骨橋蛋白及Ⅰ型膠原蛋白基因等表達，促進成骨細胞成熟。Ⅰ型膠原蛋白引導(dǎo)局部一定濃度的磷酸鹽和鈣沉積形成羥磷灰石發(fā)生礦化形成骨基質(zhì)。ROS對成骨細胞產(chǎn)生促凋亡機制主要作用于p66shc和FoxO轉(zhuǎn)錄因子。

    MariaA等人通過對UAMS-32細胞加入一種能阻斷H2O2誘導(dǎo)p66shc磷酸化的阻斷劑Ly333531處理后，發(fā)現(xiàn)H2O2誘導(dǎo)成骨細胞凋亡作用被阻斷，接著加入一種蛋白激酶C（PKC）β強激活劑佛波酯（PMA），發(fā)現(xiàn)可扭轉(zhuǎn)前者阻斷效應(yīng)。通過慢病毒傳導(dǎo)使用短發(fā)夾RNA使p66shc沉默后，PMA激活的凋亡效應(yīng)及核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）轉(zhuǎn)錄均可被阻斷。由此可推測出ROS是通過激活PKCβ誘使可調(diào)節(jié)p66shc絲氨酸（Ser36）磷酸化，并使其從胞質(zhì)進入線粒體，放大H2O2的產(chǎn)生以及激活JNK通路誘使成骨細胞凋亡。

    此外，研究發(fā)現(xiàn)ROS也可通過磷酸化腫瘤抑制蛋白p53,使調(diào)節(jié)蛋白p66shc磷酸化，將ROS信號轉(zhuǎn)化為對成骨細胞的凋亡作用，同時p53也能直接抑制成骨細胞分化標志基因Runx2和Osterix的表達。磷酸化的p66shc還可激活下游不同的效應(yīng)分子I-κB并使其磷酸化，將NF-κB釋放入核，激活成骨細胞內(nèi)的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-6基因表達。TNF-α能夠抑制絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Akt）通路的激活抑制FoxO磷酸化，使其停留在核內(nèi)，激活FoxO轉(zhuǎn)錄表達抗氧化酶如MnSOD、CAT基因，延長靜息期，對成骨細胞起到保護作用。

    然而過多的ROS通過激活FoxO轉(zhuǎn)錄還可將有限的β-catenin從TCF/LEF轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)向FoxO轉(zhuǎn)錄，降低成骨細胞的形成。綜合以上發(fā)現(xiàn)，ROS不僅通過PKCβ/p53/p66shc/JNK誘導(dǎo)成骨細胞凋亡，還通過激活JNK通路及抑制Akt通路共同將Wnt/β-catenin信號通路中TCF/LEF轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)向FoxO轉(zhuǎn)錄，降低成骨細胞的生成，最終減少成骨細胞數(shù)量，降低骨形成作用，引起骨質(zhì)疏松癥。

    氧化應(yīng)激對骨細胞的影響：骨細胞來源于在皮質(zhì)和網(wǎng)狀骨質(zhì)的骨重建過程中，小部分成骨細胞嵌入骨基質(zhì)中而形成。其既能接觸到骨表面，還能延伸至骨髓室，形成主要為骨陷窩小管系統(tǒng)的骨網(wǎng)絡(luò)，作為一種對機械承載力高度靈敏的傳感器來影響骨重建。

    過去認為骨細胞僅僅是包埋在礦化骨基質(zhì)中的支撐物——即“懶惰”細胞，然而越來越多的研究發(fā)現(xiàn)其通過調(diào)節(jié)破骨生成因子核因子κB受體活化因子配體（RANKL）和骨保護素（OPG）來影響骨吸收和激活SOST基因表達，從而促進硬化蛋白（Sclerostin）生成來影響骨形成，同時它通過牙基質(zhì)蛋白1和成纖維生長因子23來調(diào)節(jié)骨內(nèi)磷酸鹽的平衡。

    因此，骨細胞開始作為協(xié)調(diào)骨及礦物代謝的多功能細胞，儼然已成為骨質(zhì)疏松研究中的熱點。骨細胞作為長壽命細胞，較成骨及破骨細胞更易受到氧化應(yīng)激的影響。大量在嚙齒動物和人體中的實驗表明：隨著機體衰老后引起氧化應(yīng)激，骨細胞的數(shù)量逐漸減少且生存能力減弱。Halloran與其同事從C57BL/6老鼠中發(fā)現(xiàn)衰老后的老鼠骨細胞數(shù)量減少且骨髓中可溶性的RANKL與Sclerostin水平降低。

    然而，盡管RANKL水平降低與衰老后網(wǎng)狀骨質(zhì)破骨細胞減少的結(jié)果一致，但Sclerostin水平降低從而促進Wnt成骨通路激活卻與衰老后成骨細胞數(shù)量減少相矛盾。ShahnazariM等人通過對衰老老鼠骨髓中的骨代謝生化標記物檢測發(fā)現(xiàn)，骨髓中的生化標記物水平變化僅能反應(yīng)骨小梁網(wǎng)狀骨丟失情況，成骨細胞抑制因子Sclerostin水平降低可能是一種對衰老導(dǎo)致成骨細胞譜系靜息的代償反應(yīng)，其可能通過促進造骨祖細胞增殖或分化來緩解由于衰老導(dǎo)致的成骨細胞活力降低。

    氧化應(yīng)激對破骨細胞的影響

    破骨細胞來源于骨髓造血干細胞中單核巨噬細胞系。ROS對破骨細胞的影響不同于對骨形成相關(guān)細胞的直接影響，而是通過**骨形成相關(guān)細胞產(chǎn)生OPG、巨噬細胞集落**因子（M-CSF）和RANKL等重要調(diào)節(jié)因子，識別破骨細胞前體細胞及破骨細胞傳導(dǎo)骨吸收信號，間接地影響破骨細胞的分化、生存和活化。M-CSF和RANKL是破骨細胞生成的兩種必需因子，它們能促進破骨細胞分化與增殖，阻止破骨細胞凋亡并延長其壽命，促進破骨細胞成熟，引起破骨細胞標志基因如抗酒石酸酸性磷酸酶（TRACP）、降鈣素受體等的表達，最終向細胞外定向分泌HCl和溶解酶，使得骨組織脫礦、降解及溶解，形成骨陷窩。

    研究表明，RANKL/核因子κB受體活化因子（RANK）/OPG是影響破骨細胞分化、成熟的主要通路。ROS、激素、生長因子和細胞因子等如活性維生素D3、雌激素、甲狀旁腺素、轉(zhuǎn)化生長因子-β、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2、IL-6、TNF-α等都是通過調(diào)節(jié)OPG、RANKL介導(dǎo)破骨細胞生成。RANKL/RANK/OPG信號作為Wnt/β-catenin信號通路的下游部分，與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生、發(fā)展存在密切相關(guān)性。

    氧化應(yīng)激條件下，ROS將Wnt/β-catenin信號通路中TCF/LEF轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)向FoxO轉(zhuǎn)錄，抑制成骨細胞的生成和分化，促進成骨細胞凋亡的同時也下調(diào)OPG和上調(diào)RANKL的表達，使成骨細胞OPG和RANKL表達失偶聯(lián)。RANKL與它的同族特異性受體RANK結(jié)合，激活NF-κB、JNK、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）和Akt通路，誘導(dǎo)破骨細胞重要的轉(zhuǎn)錄因子包括原癌基因c-fos、T細胞核因子c1等的表達，**破骨細胞前體分化，活化成熟的破骨細胞，阻止破骨細胞凋亡。同時在破骨細胞內(nèi)，RANKL可通過腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6/Ras相關(guān)的C3肉毒底物1/Nox1（TRAF6/Rac1/Nox1）途徑產(chǎn)生ROS,直接參與骨基質(zhì)的降解。

    氧化應(yīng)激對骨基質(zhì)的影響

    骨組織中的細胞外基質(zhì)包括有機成分和無機成分，有機成分主要為各種膠原蛋白，無機成分為羥磷灰石結(jié)晶。異常增多的ROS和破骨細胞內(nèi)的基質(zhì)金屬蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶能損傷蛋白質(zhì)的巰基和氨基，使蛋白質(zhì)變性與交聯(lián)，破壞膠原和纖維連接蛋白。破骨細胞內(nèi)分泌的TRACP能夠溶解無機成分，致使骨基質(zhì)脫礦。此外，破骨細胞通過NADPH/NADP+氧化酶系統(tǒng)直接產(chǎn)生ROS,參與骨基質(zhì)的降解。值得注意的是，許多生長因子如胰島素類生長因子-1（IGF-1）富含于骨基質(zhì)中，其能通過磷脂酰肌醇激酶/Akt/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（PI3K/Akt/mTOR）途徑促進BMSCs定向分化，然而這種促骨形成作用又是由ROS及破骨細胞的降解基質(zhì)介導(dǎo)的。

    抗氧化治療對骨質(zhì)疏松癥的預(yù)后

    ROS通過激活PKCβ/p53/p66shc/JNK信號通路誘導(dǎo)成骨細胞凋亡，雌激素則通過抑制PKCβ誘導(dǎo)的p66shc磷酸化機制阻斷ROS引起的成骨細胞凋亡。因此可以推測出氧化應(yīng)激可能是隱藏于與衰老相關(guān)的骨量減少、骨脆性增加的骨質(zhì)疏松癥的主要病因。雌激素隨機體衰老減少，其抗氧化作用逐漸減弱，機體便加快了衰老對骨的作用。目前治療骨質(zhì)疏松癥的藥物大多從抗氧化劑著手，但大多數(shù)抗氧化劑機制僅僅局限在消除自由基的基礎(chǔ)和影響細胞信號通路的表象上，并未涉及到對作用位點的生物大分子的具體結(jié)構(gòu)和控制基因表達的研究上。

    總結(jié)與展望

    綜合上述發(fā)現(xiàn)，在氧化應(yīng)激條件下，ROS一方面氧化PUFAs激活ROS/FoxO/PPARγ/β-catenin途徑削弱BMSCs向成骨細胞定向分化及抑制其增殖，PKCβ/p53/p66shc/JNK途徑誘導(dǎo)成骨細胞凋亡，并激活JNK通路及抑制Akt通路共同將Wnt/β-catenin信號通路中TCF/LEF轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)向FoxO轉(zhuǎn)錄，降低成骨細胞的骨形成作用。另一方面，上調(diào)骨形成相關(guān)細胞表面RANKL的表達，促進破骨細胞分化及成熟并直接或間接參與骨基質(zhì)的降解，最終打破骨吸收和骨形成之間的骨重建平衡，引起骨質(zhì)疏松癥。

    然而其中許多作用機制如氧化應(yīng)激對骨細胞的作用有待進一步的深入研究。此外，骨質(zhì)疏松癥發(fā)生及發(fā)展涉及多條通路，各個通路間存在信號串話的情況，但現(xiàn)今的文獻沒有對其相關(guān)聯(lián)的通路有一個系統(tǒng)且清晰的概括。因此，有必要對通路中涉及到的多種受體配體、生長因子、轉(zhuǎn)錄因子、基因調(diào)控以及通路之間的關(guān)系進行大量研究，便于更好的指導(dǎo)臨床應(yīng)用和新藥研發(fā)。