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    免疫組織化學(xué)是一門實(shí)驗(yàn)性很強(qiáng)的技術(shù)操作，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都必須有自己摸索的合適的實(shí)驗(yàn)條件并保持最佳的試劑，操作人員也需要熟悉實(shí)驗(yàn)操作步驟與原理。以下是一些是免疫組織化學(xué)常用的基本原理和基本技術(shù)。

    免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry)又稱免疫細(xì)胞化學(xué)(immunocytochemistry)，是指帶顯色劑標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對(duì)相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位、定量測(cè)定的一項(xiàng)技術(shù)。它把免疫反應(yīng)的特異性、組織化學(xué)的可見性巧妙地結(jié)合起來(lái)，借助顯微鏡(包括熒光顯微鏡、電子顯微鏡)的顯像和放大作用，在細(xì)胞、亞細(xì)胞水平檢測(cè)各種抗原物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、病原體以及受體等)。

    一、基本原理

    抗體和抗原之間的結(jié)合具有高度的特異性，免疫組織化學(xué)正是利用了這一原理。先將組織或細(xì)胞中的某種化學(xué)物質(zhì)提取出來(lái)，以此作為抗原或半抗原，通過免疫動(dòng)物后獲得特異性的抗體，再以此抗體去探測(cè)組織或細(xì)胞中的同類的抗原物質(zhì)。由于抗原與抗體的復(fù)合物是無(wú)色的，因此還必須借助于組織化學(xué)的方法將抗原抗體結(jié)合的部位顯示出來(lái)，以其達(dá)到對(duì)組織或細(xì)胞中的未知抗原進(jìn)行定性，定位或定量的研究。

    幾種常用的免疫組織化學(xué)方法的原理

    1.免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)

    將已知抗體標(biāo)上熒光素，以此作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原，在熒光顯微鏡下觀察。當(dāng)抗原抗體復(fù)合物中的熒光素受激發(fā)光的照射后會(huì)發(fā)出一定波長(zhǎng)的熒光，從而可以確定組織中的抗原定位或定量。

    2.免疫酶細(xì)胞化學(xué)

     是目前免疫組織化學(xué)研究中最常用的技術(shù).基本原理是先以酶標(biāo)記的抗體與組織或細(xì)胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，通過光鏡或電鏡，對(duì)細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原進(jìn)行定位或定性研究。

    3.免疫膠體金技術(shù)

    就是用膠體金標(biāo)記一抗，二抗或其他的能特異性的結(jié)合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作為探針，對(duì)組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原進(jìn)行定性，定位或定量研究.由于膠體金的電子密度高，多用于免疫電鏡的單標(biāo)記或多標(biāo)記的定位研究。

    二、免疫組織化學(xué)基本技術(shù)

    1.材料

    免疫組織化學(xué)可用于多種材料.如實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，人體組織，細(xì)胞和體外培養(yǎng)細(xì)胞都可用于免疫組化研究。

    1).實(shí)驗(yàn)動(dòng)物　種類很多，以狗，兔，大鼠和小鼠最為常用.關(guān)鍵是取材迅速，大小適宜，固定充分。

    2).人體材料　包括活檢和手術(shù)切除的標(biāo)本，以及通過各種手段收集的細(xì)胞都可用于免疫組化研究。如脫落細(xì)胞、穿刺涂片、骨髓涂片、血涂片等。

    3).體外培養(yǎng)的細(xì)胞標(biāo)本　根據(jù)所培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特性采用不同的方法，對(duì)于貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞可采用在培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿底部放置載玻片，讓細(xì)胞在其上面生長(zhǎng)，到時(shí)將載玻片取出進(jìn)行固定，染色、懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞可采用離心涂片或離心后細(xì)胞團(tuán)塊固定，脫水，包埋，切片的方法進(jìn)行免疫組織化學(xué)研究。

    2 .固定

    固定的目的在于保持組織的形態(tài)和結(jié)構(gòu)的完整，盡量保存組織中的抗原，使其不被破壞或擴(kuò)散，以減少非特異性染色或假陽(yáng)性，假陰性的結(jié)果。

    選擇固定方法的原則是：

    在保持組織形態(tài)的完好和被檢測(cè)抗原的前提下，盡量應(yīng)用濃度最低的固定劑及最短的固定時(shí)間。

    常用固定劑

    (1).醛類固定劑 起作用是使組織之間相互交聯(lián),將抗原保存在原位.此類固定劑的特點(diǎn)是對(duì)組織的穿透力強(qiáng),組織收縮性小.常用的有甲醛,多聚甲醛和戊二醛.可單用也可聯(lián)合使用。

    1).3% 中性甲醛固定液液：

    配制： 30%甲醛10ml, 0.01mol/L PH 7.4 PBS 90ml

    特點(diǎn)：滲透性好，能完好地保護(hù)組織結(jié)構(gòu)和某些抗原。由于交聯(lián)作用會(huì)影響細(xì)胞膜的通透性，會(huì)遮蔽部分抗原，染色前最好用酶消化，以暴露抗原決定簇。

    2).4%多聚甲醛緩沖液：

    配制：40g多聚甲醛溶于0.1mol/L PBS 500ml， 加熱攪拌(注意不要沸騰)至溶液清亮后，室溫下冷卻后加PBS，使總?cè)萘繛?000ml。

    特點(diǎn)：此固定劑對(duì)抗原的保護(hù)優(yōu)于甲醛緩沖液但價(jià)格高與甲醛。

    3).戊二醛-多聚甲醛緩沖液

    配制：在上述溶液中加入1%的戊二醛。

    特點(diǎn)：多用于電鏡的免疫組織化學(xué)研究。

    4).Bouin液

    配制：40%甲醛250ml，冰醋酸50ml，飽和苦味酸750ml。

    特點(diǎn)：穿透力強(qiáng)，組織收縮小。 比單獨(dú)用甲醛固定更適合于免疫組織化學(xué)研究。

    5).PLP液 (過碘酸-賴氨酸-多聚甲醛固定液)

    此固定劑比較適合富含糖類組織的固定，對(duì)超微結(jié)構(gòu)及許多抗原的保存均較好，但配制比較繁瑣。

    (2).丙酮及醇類固定劑

    固定原理是使組織中的蛋白質(zhì)和糖類沉淀。此類固定劑的穿透能力強(qiáng)，對(duì)抗原保存較好，但對(duì)小分子蛋白質(zhì)及多肽等物質(zhì)的保存效果較差。常與其他固定劑 如 冰醋酸，乙醚,氯仿等混合使用。

    1).AAA液：純酒精85ml，冰醋酸5ml，濃甲醛10ml。

    2).Clzrke液：純酒精95ml，冰醋酸5ml 多用于冰凍切片的后固定。

    3).Carnoy液： 純酒精60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml。 多用于癌基因蛋白，抗癌基因蛋白等抗原 的固定保存。

    4).丙酮：常用于冰凍切片和細(xì)胞涂片的后固定。用前在4度冰箱預(yù)冷，切片在冷丙酮中固定5～10min。

    (3).其他固定劑

    1).Zenker液 適合免疫球蛋白抗原的檢測(cè)。

    2).四氯化鋨液是電鏡研究中所必需的固定液.

    選擇最佳固定劑的標(biāo)準(zhǔn)是：組織形態(tài)保存良好；最大限度地保存抗原的抗原性。中性甲醛和多聚甲醛是應(yīng)用最廣的固定劑。

    3. 包埋

    包埋的目的是使組織保持一定的形狀和硬度，便于用切片機(jī)切片.常見的包埋劑及方法如下：

    (1).石蠟包埋：石蠟是組織病理切片中最常用的包埋劑，需要脫水、透明、浸臘等過程。

    (2).冰凍包埋：是作冰凍切片的包埋方法。 新鮮的及以固定的材料均適合于冰凍包埋，常用的包埋劑是OCT。

    (3).塑料包埋：常用的是環(huán)氧樹脂包埋劑。優(yōu)點(diǎn)是同時(shí)可以作光鏡和電鏡觀察。

    (4).碳臘包埋：較少用。包埋劑為聚乙二醇。

    4. 切片

    因?yàn)槊庖呓M化的步驟較多，要求切片薄而且平整，否則在染色過程中容易脫片。一般要求片厚在4um以下。貼片前普通的載玻片要作適當(dāng)?shù)奶幚怼?/p>

    (1)洗片 酸液浸泡過夜，流水沖洗，蒸餾水洗，95%酒精浸泡2h，擦干。

    (2)涂膠 常用的防脫片劑有：多聚賴氨酸，APES及白乳膠。

    使用方法見試劑使用說(shuō)明書。

    三、常用的免疫組織化學(xué)方法

    自從1941年Coons及其同事首創(chuàng)免疫組織化學(xué)技術(shù)以來(lái)，伴隨著免疫學(xué)和組織化學(xué)理論與技術(shù)的發(fā)展，從最初的直接法，到現(xiàn)在的各種間接法的發(fā)展，免疫組織化學(xué)發(fā)生了日新月異的變化。現(xiàn)在就從最初的直接法開始到現(xiàn)在常用的免疫組織化學(xué)方法作一簡(jiǎn)單介紹。

    1.直接法：是最早出現(xiàn)的方法,是將酶直接標(biāo)記在特異性抗體上，與標(biāo)本中的抗原結(jié)合，讓酶催化底物反應(yīng)產(chǎn)生有色物質(zhì)，可以在光鏡下檢測(cè)。直接法放大作用小，不夠敏感，且標(biāo)記一種抗體只能檢測(cè)一種抗原,所以應(yīng)用就受到了限制。

    2.間接法：是將酶標(biāo)記在第二抗體上，形成抗原/一抗 /二抗-酶復(fù)合物,最后酶底物顯色來(lái)放大信號(hào)。由于一抗多來(lái)源于兔，小鼠或山羊等有限的幾種動(dòng)物，所以僅需制備酶標(biāo)記的一抗來(lái)源的IgG就可以檢測(cè)很多的抗體，放大效果也有所提高。為了追求更大的放大效果，人們有發(fā)明了PAP的橋聯(lián)法，雖然敏感性有所提高，但是同時(shí)出現(xiàn)了較高的非特異性背景，及假陽(yáng)性等問題，隨后被生物素-卵白素系統(tǒng)所取代。

    3.生物素-卵白素系統(tǒng) (親和免疫組織化學(xué))：生物素(biotin)是一種244Da的小分子的維生素。卵白素(avidin)又稱作抗生物素是一種68kDa的糖蛋白。生物素與抗生物素有很強(qiáng)的親合力，兩者一旦結(jié)合就很難解離。同時(shí)，生物素和抗生物素都具有與其他示蹤劑，如熒光素，過氧化物酶等相結(jié)合的能力。近年來(lái)，應(yīng)用這一系統(tǒng)特性，研制出了許多檢測(cè)方法，如**法，SP法等。