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     文獻(xiàn)標(biāo)題：RIOK3-Mediated Phosphorylation of MDA5 Interferes with Its Assembly and Attenuates the Innate Immune Response.

    文獻(xiàn)來源：Cell Rep 2015 Apr 7

    天然免疫應(yīng)答對(duì)于抵抗病毒的感染十分重要。RIG-I與MDA-5是最常見的細(xì)胞內(nèi)部識(shí)別病毒RNA的信號(hào)分子，它們的識(shí)別與激活能夠傳遞胞內(nèi)的抗病毒免疫反應(yīng)。MDA-5能夠識(shí)別較長(zhǎng)的雙鏈RNA分子，而RIG-I識(shí)別的序列長(zhǎng)度較短。

    對(duì)于MDA-5來講，它由N端的兩個(gè)C**結(jié)構(gòu)域，中部的RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域以及C端的一個(gè)結(jié)構(gòu)域（CTD）構(gòu)成，其中CTD負(fù)責(zé)識(shí)別胞內(nèi)的雙鏈病毒RNA分子。隨后，MDA-5圍繞RNA分子通過蛋白-蛋白相互作用彼此頭尾相連，最終形成纖維狀的結(jié)構(gòu)。這一結(jié)構(gòu)能夠促進(jìn)C**的寡聚化，而寡聚化后的C**復(fù)合體則能夠進(jìn)一步結(jié)合位于線粒體上的MAVS蛋白進(jìn)行信號(hào)的傳遞。以前的研究顯示MDA5的活性受到其C**的磷酸化調(diào)控，然而內(nèi)在的分子機(jī)制卻仍不清楚，同時(shí)C端的功能也同樣不清楚。

    最近，來自北海道大學(xué)的Tsukasa Seya課題組在《cell report》雜志上發(fā)表了他們對(duì)MDA-5 C端磷酸化的分子機(jī)制以及其作用的相關(guān)研究。

    首先，作者通過體外的生化實(shí)驗(yàn)證明MDA-5存在磷酸化形式。他們發(fā)現(xiàn)在HEK293細(xì)胞中過表達(dá)的FLAG-MDA-5在SDS-PAGE中移動(dòng)速度較慢，而在加入磷酸酶CLAP后該蛋白的遷移速度明顯加快。之后的突變分析證明該磷酸化存在于MDA-5的C-端。

    為了找到作用于MDA-5的蛋白激酶，作者進(jìn)行了酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：RIOK3與MDA-5 C-端存在相互作用，后續(xù)的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證明了這一結(jié)論。另外，作者還通過共聚焦顯微成像的手段證明了MDA-5與RIOK3存在共定位，而且它們不論在**前后均位于胞漿中，而遠(yuǎn)離線粒體。之后，作者通過RNAi的手段人為降低了RIOK3的水平，結(jié)果MDA-5的磷酸化程度明顯上升。這一結(jié)果說明RIOK3參與了MDA-5的磷酸化。

    接下來，作者希望了解RIOK3對(duì)MDA-5的磷酸化對(duì)于這一信號(hào)究竟有什么影響。通過在HEK293中過表達(dá)MDA-5與RIOK3,作者發(fā)現(xiàn)RIOK3的存在能夠明顯抑制MDA-5過表達(dá)帶來的免疫信號(hào)增強(qiáng)，然而，MAVS過表達(dá)產(chǎn)生的免疫信號(hào)并不能被RIOK3所抑制，這說明RIOK3的作用產(chǎn)生在MAVS的上游。另外，作者通過RNAi人為下調(diào)HEK293細(xì)胞中RIOK3的表達(dá)量以及使用RIOK3敲除的HEK293細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)也得到了相同的結(jié)論。

    之后，作者利用突變分析的手段證明了RIOK3特異性磷酸化MDA-5在828位的絲氨酸。另外，作者還通過生化實(shí)驗(yàn)證明了RIOK3對(duì)MDA-5的磷酸化抑制了其在激活條件下形成多聚體的活性。綜上，通過一系列生化試驗(yàn)，作者證明了一個(gè)新的抗病毒免疫調(diào)控機(jī)制。