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    四、流式細胞儀免疫分型實驗

    1.樣本采集、運輸、保存和操作
    （1）樣本類型：適用于多種臨床標本，如外周血、骨髓穿刺液、骨髓活檢物、淋巴樣組織活檢物、漿液、腦脊液、皮膚、黏膜（內(nèi)窺鏡活檢物）、細針穿刺物等等。
    （2）抗凝劑的選擇：外周血標本可采用EDTA、ACD或肝素抗凝。如果用同一份血標本做白細胞計數(shù)和流式分析，則應(yīng)用EDTA抗凝。骨髓穿刺可用肝素。其他體液用EDTA、ACD或肝素均可，但保存的樣本活性可能會降低，EDTA的優(yōu)點是成熟髓性細胞貼壁造成的損失及血小板聚集較小，但細胞散射光特征丟失較肝素標本快；由于相對大量的ACD會通過改變pH而影響骨髓細胞活性問題，通常不推薦用ACD做骨髓穿刺抗凝劑。
    （3）樣本的保存：樣本的完整性和細胞活性與抗凝劑的選擇、運輸、保存和溫度息息相關(guān)。
    ①理想狀態(tài)下，樣本應(yīng)在采集后立刻進行處理和染色。
    ②短期保存（1小時或更短）應(yīng)在室溫（18-22℃）。
    ③長時間保存血或骨髓標本室溫即可，有些樣本可能4℃為佳。
    ④標本保存的時間上限取決于標本類型及其保存條件。
    ⑤肝素抗凝的血和骨髓通?？杀４嬷?8-72小時；
    ⑥EDTA抗凝的血和骨髓可保存至12－24小時。
    ⑦ACD抗凝的血和骨髓可保存至72小時，但
    ⑧對于只做胞內(nèi)染色的樣本，可固定細胞以長期保存。但？quot;固定－染色“的方法取決于要分析的抗原特性和染色方式，采用之前一定要進行新鮮標本的對照和驗證實驗。

    2.樣本制備
    （1）單細胞懸液的制備
    ①血和骨髓：天然單細胞懸液。當有血凝塊時，應(yīng)用50um尼龍網(wǎng)過濾，同時進行細胞計數(shù)和血涂片以判斷靶細胞群體是否仍然存在。
    ②組織塊：機械分離和酶分離兩種方法。分離不僅是要獲得最大產(chǎn)量的單細胞懸液，還要盡量保證細胞結(jié)構(gòu)的完整性和抗原性。大多數(shù)淋巴樣組織可用輕柔的機械方法快速分離，并保持收獲細胞的相對完整。某些組織由于細胞間連接緊密，需在機械分離的基礎(chǔ)上用蛋白水解酶如胰蛋白酶、胃蛋白酶。骨髓標本亦可能因骨細胞成分污染而需要酶消化。但使用酶法一定要確認酶的使用沒有改變、減弱靶抗原的表達，細胞活性沒有顯著降低。
    （2）分離靶細胞群體
    樣本的任何處理方式都可能導(dǎo)致靶細胞群體的丟失。所以應(yīng)盡可能使用最接近原始標本狀態(tài)的處理過程。去除紅細胞是流式分析要求的至少步驟。兩種方法：
    ① 紅細胞裂解：較佳。操作簡單、快、并最可能保持原始標本的白細胞分布。溶血劑的選擇應(yīng)基于其選擇性去除成熟紅細胞而最小程度的影響其他細胞的特點。最好在染色后溶血。若在染色前溶血，需確認：抗原性不被溶血過程改變； 溶血劑被徹底洗去，細胞和抗體結(jié)合的動力反應(yīng)未受影響；所用溶血劑不含固定劑，否則會影響細胞活性及表面標記結(jié)果 。
    ② 度梯度離心：白血病細胞回收較好并可能得到富集，同時去除死細胞。但費時，白血病細胞的相對頻率較難分析，某些重要細胞群體可能選擇性丟失。根據(jù)密度梯度原理，若白血病細胞沒有與淋巴細胞相似的浮力密度即可能丟失。所以用此方法時應(yīng)檢查各層細胞特性以防止靶細胞的丟失。
    （3）估細胞懸液
    ①樣本外觀：有嚴重溶血和血凝塊的標本可能會有白細胞的損壞以及細胞亞群的丟失或改變，應(yīng)棄用。
    ②細胞丟失和分布：確認細胞形態(tài)和原始標本相似。密度梯度離心之后更應(yīng)檢查細胞分布。可做血涂片判斷。
    ③細胞計數(shù)和濃度調(diào)整：廠家推薦的抗體濃度通常是假定靶細胞數(shù)量在正常范圍內(nèi) （500,000-1,000,000／testAb）。白細胞數(shù)量上的顯著變化會帶來染色模式的變化。而白血病標本常常有異常的白細胞數(shù)量，骨髓標本也可能被外周血稀釋，這些標本的細胞性可能有極大的變異。因此有些標本沒有足夠的細胞做流式分析，有些則由于細胞量大，正常濃度下的抗體相對不足，不能飽和所有的結(jié)合位點，導(dǎo)致假陽性結(jié)果。所以染色前的細胞計數(shù)非常必要。推薦方法： WBC<1000/uL: 用200uL全血并調(diào)整相應(yīng)溶血劑用量； WBC:1000-10000/uL, 用100uL全血并用溶血劑標準量； WBC:10000-20000/uL, 用50uL全血并調(diào)整相應(yīng)溶血劑用量； WBC>20000/uL，用稀釋至（2）（3）范圍內(nèi)。骨髓標本常常要在PBS 1:10稀釋后計數(shù)。應(yīng)該指出，由于不同的標本中不同系列的細胞比例不同，調(diào)整細胞總數(shù)不一定合適每一個系列特異的抗體。實驗室若選擇不同于廠家推薦的方法（如自己稀釋抗體），抗體一定需要進行測試以得到抗體和細胞的最佳比率。
    ④細胞活性：死細胞對許多抗體有非特異性染色，有些抗原同時存在于胞膜和胞漿，這就使樣本的細胞活性檢測變得重要，尤其7-AAD或EMA（ethidium monoacide）?；罴毎麑⒕苋具@些染料。此方法的優(yōu)勢是細胞表面標志和活性分析可同時進行，通過設(shè)門即可得到活細胞的染色特性。尤其適用于高度壞死的樣本。樣本染色后需固定。應(yīng)在加固定劑之前洗去多余的7AAD，以保證區(qū)分的是固定前細胞的死活狀態(tài)。但隨著時間延長，7AAD會在固定的細胞群體重新分配，死活細胞的區(qū)分變難。對于染色后常規(guī)固定并在固定后12小時以上分析的標本，最好用EMA。EMA與死細胞DNA穩(wěn)定的共價結(jié)合保證了長時間固定后仍能很好地區(qū)分固定前的死活狀態(tài)。二是手工檢測：使用Trypan blue 或其他細胞活性染料。
    （4）細胞染色
    ①細胞表面染色：大多數(shù)可幫助白血病免疫分型的抗原都在細胞膜上。但由于許多抗原也同時存在細胞內(nèi)，所以在細胞表面抗原檢測時應(yīng)特別注意保持細胞膜的完整以保證檢測的特異性。例如免疫球蛋白重鏈在細胞內(nèi)和表面的存在有著不同的意義，檢測表面標記必須是未固定的活細胞。
    ②細胞內(nèi)染色：有些胞內(nèi)特異性抗原的檢測對白血病的免疫分型尤為重要，如TdT, MPO, cCD3, cCD22, 以及胞漿內(nèi)Ig的表達。胞內(nèi)染色的關(guān)鍵是使細胞膜通透，把抗體導(dǎo)入胞漿而不影響細胞結(jié)構(gòu)的完整性。要保證固定和透膜的步驟不影響有關(guān)標記的抗原性以及和抗體的結(jié)合。
    ③胞膜和胞內(nèi)的同時染色：通常，先胞膜染色，固定，膜通透和胞內(nèi)染色，最后是DNA染色。固定劑和通透劑都可能對細胞和參數(shù)有不同的多重影響，應(yīng)根據(jù)情況選擇。每一步染色對熒光素的選擇和抗體的選擇都很重要。如，用于表面標記的熒光素應(yīng)不被隨后的固定和通透步驟所影響，而對于胞內(nèi)染色，所用的熒光素應(yīng)足夠小能穿透到胞膜內(nèi)。

    3. 抗體組合的確定：
    選擇抗體組合的技術(shù)性考慮：基于血液腫瘤的復(fù)雜性，提供一個通用的抗體選擇策略是不現(xiàn)實的。國際上迄今也沒有一致性的抗體組合。應(yīng)該意識到，沒有一個神奇的既小又功能齊全的抗體組合可以解決所有的臨床相關(guān)答案。一個局限性的小組合也可能影響對樣本的正確評估和分類。確認細胞異常的能力與所用抗體的數(shù)量直接成正比。
    （1）選擇抗體組合的基本原則如下：
    1）所選的抗體組合應(yīng)足夠?qū)?，可以鑒別樣本中的所有細胞亞群包括正常和異常群體?？贵w的數(shù)量越多，檢測的靈敏度越高。應(yīng)該指出，由于腫瘤細胞常常缺少細胞的正常標記或表達異常，所以特異性抗體一定程度上的重復(fù)選擇有時是必要的。
    2）抗體的選擇應(yīng)可以區(qū)分正常和異常細胞，正常細胞可作為實驗的內(nèi)參照，異常細胞的表達比例也更準確。如現(xiàn)在用CD45抗體來區(qū)分正常和幼稚細胞，此方法尤其在幼稚細胞含量少時更顯優(yōu)勢。
    3）熒光強度和表位密度應(yīng)同時考慮。對表達少的抗原表位應(yīng)盡可能選擇強度強的熒光素。
    4）必要時用活性檢測排除死細胞較強的非特異性染色。國外統(tǒng)計，約70%組織樣本和48%血或骨髓標本有活性檢測結(jié)果。
    5）實驗人員應(yīng)了解所用抗體的反應(yīng)細胞譜，以及與特定熒光素結(jié)合后的染色模式。相同的CD編號的不同抗體可能有不同的結(jié)合模式。
    （2）常用的方案考慮：大而全的抗體組合：全面了解抗原表達，無需額外染色，省時但 費用高。先用篩查試劑了解樣本的一般情況，再根據(jù)所得信息采用第二線特異性更高的抗體組。經(jīng)濟，但費時，也需要正確的抗體選擇的策略性決定。但考慮到所用時間和設(shè)備費用，只有約30%國外實驗室采用此法。基于臨床或形態(tài)學(xué)的資料，選用有目標性的抗體組合以確認可疑的診斷或分類。

    4.樣本獲取
    通常，每個標本應(yīng)獲取1-2x104個有核細胞的熒光和散射光信號，微小殘余病變分析則需5x104個細胞。惡性細胞常有較寬的大小和粒度范圍，獲取時最好收集無門的數(shù)據(jù)以保留所有未知異常細胞群體的所有特性。免疫熒光信號要求對數(shù)放大和至少256道的分辨率。無論選擇對數(shù)或線性放大都要以保證異常細胞都能被檢測到。

    5.數(shù)據(jù)分析
    只有通過多參數(shù)分析，才能最大程度地區(qū)分異質(zhì)的樣本中的正常和異常細胞。多參數(shù)分析意味著綜合細胞的光散射和多色熒光特征。最少的要求應(yīng)是4個參數(shù)（2個光散射和2個熒光參數(shù)）。采用的參數(shù)越多，分析步驟越復(fù)雜，流式免疫分型的靈敏度越高。
    （1）分析技術(shù)：數(shù)據(jù)的分析方式隨樣本的特性、抗體組合及臨床情況的不同而變化。但總的原則是要用多參數(shù)的數(shù)據(jù)創(chuàng)造可以區(qū)分正常和異常細胞的圖形，如FSC vs. SSC, FL vs. FL, Scatter vs.FL等，散射光與熒光參數(shù)的綜合分析常常能提供有效的信息。
    （2）分析步驟：首先分析所有細胞的抗原表達情況，鑒別出正常細胞和異常細胞群體，正常細胞的表現(xiàn)可以作為整個實驗染色過程的內(nèi)部參照，提供實驗一致性與否的客觀證據(jù)，異常細胞則通過進一步設(shè)門分析確定表型特點。
    （3）設(shè)門：即選擇特殊的細胞群體分析其各個參數(shù)的表現(xiàn)，是一個基本的分析技巧。把分析局限在門內(nèi)的細胞群體的前提是門內(nèi)的細胞代表所有感興趣的細胞，而且沒有其他細胞的污染。一般來說，不同疾病的設(shè)門策略亦不同，常用的FSC vs. SSC的設(shè)門方式可能不總是適用于L&L分析，如在急性白血病中，CD45和SSC的雙參數(shù)顯示是鑒別幼稚細胞的一個簡單而有效的方法；在B細胞淋巴瘤中用一個全B細胞的抗體設(shè)門來看抗κ鏈和抗λ鏈的表現(xiàn)；T細胞淋巴瘤時用一個全T細胞抗體設(shè)門使腫瘤細胞的分型更加明確。另外，通過細胞特異的抗原表達確定其光散射區(qū)域的”backgate“的方法也很實用，如通過CD14vs.CD45的雙參數(shù)分析區(qū)分多個區(qū)域的淋巴、單核和粒細胞群體。
    （4）分析異常細胞群體：確定異常細胞群體后要進一步分析其免疫分型。分析抗原表達要注意：
    ①在 L&L中，定性的描述（陽性或陰性）通常要比陽性百分率的計算更有價值。只有在設(shè)門內(nèi)細胞全部是感興趣的細胞而且熒光分布的形狀可以非常清楚地區(qū)分陽性和陰性亞群的情況下，陽性百分率才有意義。當然，在某些抗原異質(zhì)表達的群體中，可進行定性或定量的分析（X% 幼稚細胞CDX陽性）；百分率也可用于描述異常和正常細胞的比例。
    ②評估抗原表達強度是分析的重要組成部分。對于一個特異的抗體而言，熒光強度是抗原密度的反應(yīng)，同時也與所用的熒光素和獨特的熒光素抗體復(fù)合物有關(guān)。有時確認異常群體是因為沒有表達應(yīng)該表達的抗原，但有時只能從抗原表達的異常強度來判斷。如用一些髓性抗原CD14，CD33，CDw65的相對表達強度和散射光特征一起來確認單核細胞系和粒細胞系的發(fā)展成熟過程。熒光強度的評估在大多數(shù)情況下可以采用定性的資料，但由于試劑和機器上的不同，僅僅基于熒光道數(shù)的簡單標準可能并不足夠，最好以其在相同條件下相對正常細胞的強度來表示。如CD45，CD8或CD38等在不同細胞上的表達密度相差幾個對數(shù)范圍，CD22或CD4等抗原則在所謂陽性范圍內(nèi)在不同細胞類型上的區(qū)別較小。
    ③區(qū)分弱陽性和陰性群體：在某些情況下對診斷有較大的價值，如B細胞惡性腫瘤的CD5弱表達，但弱表達的判斷卻常常很難?，F(xiàn)行的標準如”20%陽性“等都仍是人為的標準。依照直方圖上與對照組相比向右移動來判斷陽性所需的最小位移也是人為的標準。可用K-S統(tǒng)計來比較直方圖的區(qū)別。亦可選用強的熒光染料，或用過量未標的抗體阻斷非特異染色，從而判斷弱陽性染色的特異與否。

    6. 數(shù)據(jù)解釋
    雖然對流式免疫分型結(jié)果的解釋最好與形態(tài)學(xué)結(jié)果綜合考慮，但流式的作用仍遠遠多于對形態(tài)學(xué)結(jié)果的簡單證實。流式可能幫助形態(tài)學(xué)確認某些診斷，也可能提出之前沒有考慮的診斷，甚至在一些典型表現(xiàn)下流式免疫分型可以在其他方法的輔助下診斷疾病，但應(yīng)盡量解釋任何流式結(jié)果和其他方法結(jié)果上的不一致，流式結(jié)果應(yīng)與臨床、形態(tài)學(xué)、細胞遺傳等其他方法綜合考慮。