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    一、 流式細(xì)胞儀在白血病免疫分型診斷的概述

    近年來白血病的免疫分型已成為診斷血液惡性腫瘤不可缺少的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。早年曾用過的熒光顯微鏡或APAAP方法基本被廢棄。國際上公認(rèn)的通用的方法是流式細(xì)胞術(shù)（FCM）。流式細(xì)胞術(shù)白血病免疫分型是利用熒光素標(biāo)記的單克隆抗體（McAb）作分子探針，多參數(shù)分析白血病細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿或細(xì)胞核的免疫表型，由此了解被測白血病細(xì)胞所屬細(xì)胞系列及其分化程度。

    1. 流式細(xì)胞儀診斷白血病的依據(jù)
    （1）FCM能快速，多參數(shù)，客觀的定性又定量測定細(xì)胞膜、漿、核的抗原表達(dá)
    （2）至今尚未發(fā)現(xiàn)白血病的特異抗原。
    （3）能用正常血細(xì)胞的單抗來進(jìn)行免疫分型是基于白血病形成的分化阻斷學(xué)說。即白血病細(xì)胞基因異常，分化受阻于某階段形成不同亞型的白血病。這群細(xì)胞充盈于骨髓。正常血細(xì)胞從多能干細(xì)胞分化、發(fā)育、成熟為功能細(xì)胞的過程中，細(xì)胞膜、細(xì)胞漿或胞核抗原的出現(xiàn)、表達(dá)增多與減少甚至消失與血細(xì)胞的分化發(fā)育階段密切相關(guān)，而且表現(xiàn)出與細(xì)胞系列及其分化程度相關(guān)的特異性。因此，這些抗原的表達(dá)與否可作為鑒別和分類血細(xì)胞的基礎(chǔ)。白血病是造血系統(tǒng)的惡性腫瘤，在形態(tài)上變化雖相當(dāng)大，但仍能表達(dá)正常血細(xì)胞所具有的抗原，因而仍可依據(jù)其抗原的表達(dá)譜對白血病進(jìn)行免疫分型。

    2. 流式細(xì)胞儀診斷白血病的意義
    （1）骨髓血細(xì)胞是形態(tài)學(xué)分型的基礎(chǔ)，F(xiàn)CM白血病免疫分型是對形態(tài)學(xué)分型的重要補(bǔ)充和進(jìn)一步深化，國際白血病MIC分型協(xié)作組認(rèn)為免疫分型對每一例急性白血病都是必不可少的，對下列情況意義更大：①用形態(tài)學(xué)、細(xì)胞化學(xué)染色不能肯定細(xì)胞來源的白血病。②形態(tài)學(xué)為急性淋巴細(xì)胞白血病（ALL）或急性未分化白血?。ˋUL）但缺乏特異性淋巴細(xì)胞系列抗原標(biāo)記。③混合性白血病。④部分髓系白血病。目前，免疫分型對粒細(xì)胞和單核細(xì)胞白血病的鑒別尚有一定困難。⑤慢性淋巴細(xì)胞白血病。⑥微小殘留白血病。
    （2）臨床預(yù)測；可根據(jù)抗原的表達(dá)情況預(yù)測病情的預(yù)后：如白血病患者有CD7+與CD34+共表達(dá)，預(yù)后不好。
    （3）疾病監(jiān)測：可監(jiān)測病程的發(fā)展，療效，可進(jìn)行微小殘留白血病的檢測。

    二、免疫分型常用的免疫標(biāo)志及其意義

    1.白血病系列分化抗原
    T淋巴細(xì)胞白血?。篊D3、CD5、CD7。
    B淋巴細(xì)胞白血?。篊D10、CD19、CD22。
    NK淋巴細(xì)胞白血?。篊D16、CD56、CD57。
    髓系白血?。篊D13、CD14、CD33、MPO（髓過氧化物酶）。
    紅白血病：GlyA（血型糖蛋白A）。
    巨核細(xì)胞白血?。篊D41、CD42、CD61。

    2.白血病系列非特異性抗原
    CD34、HLA－DR為早期細(xì)胞抗原，無系列特異性，可與CD38聯(lián)合運(yùn)用于免疫分型。一般而言，干/祖細(xì)胞CD34＋、HLA－DR＋、CD38－，原始細(xì)胞CD34＋、HLA－DR＋、CD38＋，而幼稚細(xì)胞（如早幼粒細(xì)胞）CD34－、HLA－DR－、CD38＋。

    3.白血病分化階段抗原
    T細(xì)胞抗原CD4、CD8。
    B細(xì)胞抗原：CD10、Cyμ（胞漿μ鏈）、SmIg（表面膜免疫球蛋白）、CD38和CyIg（胞漿免疫球蛋白）、CD11C。

    4.白細(xì)胞共同抗原
    CD45為白細(xì)胞共同抗原，其表達(dá)量在淋巴細(xì)胞最高，單核細(xì)胞，成熟粒細(xì)胞，早期造血細(xì)胞（blasts）依次減弱。紅細(xì)胞（中，晚幼紅細(xì)胞，成熟紅細(xì)胞）不表達(dá)CD45。用SSC/CD45 PerCP雙參數(shù)分析可十分容易鑒別骨髓和血液中的原始或成熟細(xì)胞。用兩個系列或階段特異性McAb加CD45進(jìn)行三色免疫熒光染色，經(jīng)FSC、SSC、McAbl-FITC、McAb2-PE、CD45 PerCP五參數(shù)分析，可特異地分析原幼白血病細(xì)胞的免疫表型而不受成熟細(xì)胞的干擾。

    三、白血病及淋巴瘤免疫分型

    1.AML
    MO：有低的SSC和FSC。在CD45－SSC圖上出現(xiàn)在淋巴細(xì)胞位置上，至少表達(dá)一個特異性標(biāo)志如CD13或CD116，但MPO比CD13與CD33更靈敏。一般淋系標(biāo)志陰性，但也可表達(dá)CD7或CD4。一般HLA－DR、CD34陽性，有些研究表明CD7與CD34共表達(dá)在AML且預(yù)后差。
    M1：流式上M1與M0相似不易區(qū)分，M1一般CD13＋、CD33＋、HLA－DR－，但CD34表達(dá)少于M0，可能表達(dá)部分CD15。
    M2：M0與M1的主要區(qū)別是成熟度增加，blasts減少，CD15較M1較顯著，CD34弱于M1，CD13有時表達(dá)強(qiáng)于CD33，多數(shù)病例HLA－DR（-）。CD45－SSC圖顯示從髓系blast區(qū)至成熟骨髓細(xì)胞區(qū)的連續(xù)細(xì)胞帶，CD45－SSC圖有助于確定blasts比例。
    M3：高顆粒性，具較高的SSC，但CD45較成熟C少，多數(shù)情況HLA－DR（-）或表達(dá)減少，CD34少于M2、一般CD13弱（＋），可有CD2表達(dá)。
    M4與M5：兩型表型相似，但M4較M5表達(dá)更多的CD34（＋），較之M0、M1，M4與M5有更大的FSS和SSC，CD45－SSC圖上，成熟C出現(xiàn)在單核區(qū)，重要的表型為CD13、CD33、HLA－DR、CD14和CD15，CD33可表達(dá)強(qiáng)于CD13，CD33（＋）、CD13（－）、CD34（－）很可能為M5，但只出現(xiàn)在少數(shù)病人中，部分M5可見CD56（＋）。
    M6：M6較少見且特征不明顯，一般HLA－DR，CD34、CD13、CD33陽性，CD45－SSC圖顯示主要為紅系成份。
    M7：巨核細(xì)胞白血病，在AML中少于1％。一般CD61（GpⅢa）和/或CD41（GpⅡb-Ⅲa）陽性，而注意由于血小板粘附在blasts上造成的假陽性，可以用流式雙色分析在EDTA存在下，測GpⅡb/Ⅲa與CD34以減少激活血小板的粘附。

    2.ALL：
    ALL是兒童中最常見的惡性腫瘤，約占全部腫瘤的25％，在成人，ALL約占急性白血病的25％，我們將ALL分為B祖細(xì)胞型，CD10＋或CD10－，前B細(xì)胞型，B細(xì)胞型，T細(xì)胞型。
    B祖細(xì)胞型ALL：
    在幼兒約占ALL的65％～70％，青少年為55％～60％，成人為50％。在兒童，約90％病例CD10＋，在幼兒只有少于50％病例CD10＋，blasts一般FSC、SSC很少，是FAB標(biāo)準(zhǔn)的L1或L2，一般TdT（+）HLA-DR（+），CD19（+），此型又分為2個亞型，CD10＋和CD10－，前者預(yù)后好，多數(shù)病例CD24＋，CD34＋，CD20表達(dá)隨成熟度增加而增加，B祖細(xì)胞被定義為sIg-。
    前B細(xì)胞型ALL：
    此亞型約占兒童ALL的25％，細(xì)胞一般為CD19＋，CD24，HLA－DR＋，胞漿CD22＋，CD10＋，TdT隨CD20變化，CD34多為陰性，前B亞型被認(rèn)為比B祖型預(yù)后更差，這與t（1；19）出現(xiàn)相關(guān)并由此產(chǎn)生E2A－PBX1融合蛋白，它的表型為CD19＋、CD10＋、CD9＋，不同程度CD20表達(dá)，CD34－，確認(rèn)此表型有助于診斷基因上不確定的病例。
    B細(xì)胞型ALL：
    成熟B細(xì)胞型ALL約占ALL2％～5％，B細(xì)胞型ALL較之B祖細(xì)胞型ALL有更大的FSC和SSC，在CD45－SSC圖上出現(xiàn)在淋巴和單核細(xì)胞區(qū)域，即FAB標(biāo)準(zhǔn)的L3，表型為CD19、CD20、CD22、CD24且sIg（多數(shù)為IGM）多數(shù)病例CD10＋。但成熟抗原及sIg使之區(qū)別于更早的B系A(chǔ)LL，極少數(shù)成熟B細(xì)胞ALL無FAB－L3形態(tài)。
    T－ALL：多數(shù)病例有大的FSC、SSC，在CD45－SSC圖上可能出現(xiàn)在淋系未成熟細(xì)胞和髓系未成熟細(xì)胞或單核細(xì)胞區(qū)，多數(shù)表現(xiàn)為胸腺亞型，最常見亞型為皮質(zhì)晚期表達(dá)，CD1、CD2、CD5、CD7、CD4/ CD8雙陽與極少膜表面CD3、TdT多為陽性。另一常見亞型為皮質(zhì)早期表達(dá)CD2、CD5、CD7、TdT強(qiáng)表達(dá)。髓質(zhì)期亞型表達(dá)CD2、CD5、CD7、與CD3＋CD4＋/CD3+CD8+,很少見TdT表達(dá)。前T細(xì)胞亞型，表達(dá)CD7胞漿CD3＋且無其它T細(xì)胞抗原，T細(xì)胞腫瘤的特征是喪失T細(xì)胞抗原而表現(xiàn)出其它異?？乖M合。
    雜合型白血?。?br />     隨著流式技術(shù)的廣泛應(yīng)用，我們發(fā)現(xiàn)許多病例并不能嚴(yán)格劃分為淋系或髓系，真正的雙表型病人多為t（9；22）或（11q23），現(xiàn)在雜合型的誤診率很高。最常導(dǎo)致誤診的原因是在分析中未能排除非白細(xì)胞，過度強(qiáng)調(diào)弱的非特異性結(jié)合，忽略了某些抗體缺乏系特異性，最重要的系特異性抗原在B系、T系、髓系分別為CD22、CD3和MPO。

    3.CML：
    由于慢性期顯著的細(xì)胞分化，在CD45－SSC圖上除了髓系細(xì)胞占主導(dǎo)外，只顯示一個正常骨髓像，CML可確診，CML起病與發(fā)展相對緩慢，慢性期的持續(xù)1年左右最終發(fā)展為加速期和急變期。流式細(xì)胞技術(shù)對急變期亞型的診斷具有極高價值。直接影響到治療效果。
    急變期CML主要表現(xiàn)為髓系，偶為淋系，髓性急變可表現(xiàn)出多種形態(tài)包括未分化細(xì)胞。淋性急變具典型形態(tài)特征，為CD10＋B祖細(xì)胞ALL極少有T細(xì)胞型ALL。

    4.CLL：
    CLL細(xì)胞主要為較正常淋巴細(xì)胞稍大的小淋巴細(xì)胞。免疫分型主要為：SIgM、SIgD弱表達(dá)，B系抗原為CD19、CD20、CD43、CD79a與CD5共表達(dá)，CD23表達(dá)使得CLL區(qū)別于帽細(xì)胞淋巴癌MU，即（CLL：CD23＋，MCL：CD23－），CD10－、CD23－、CD11c和CD25、CD20常弱表達(dá)，盡管CLL起病慢，但CLL病人的生存率變化很大，有染色體異常的病預(yù)后不良，最常見的三聯(lián)體trisony12、14q、13q、11q，免疫表型上沒有特異的變化而免疫表型的變化并不是提示染色體異常。最近，有研究表明，三聯(lián)體trisony12與SIg、CD20表達(dá)量高度相關(guān)，與CD23－相關(guān) 與FMC7相關(guān)。
    B型前淋巴細(xì)胞白血?。˙－DLL）較CLL更為嚴(yán)重，流式細(xì)胞技術(shù)在區(qū)分B－DLL和CLL上發(fā)揮很大作用，B－DLL多為CD5－，CD22＋，表達(dá)更強(qiáng)的sig。
    MU病人平均生存率不超過5年，與CLL在形態(tài)上很難區(qū)分，與CLL相似有CD5＋B祖細(xì)胞，但Sig表達(dá)強(qiáng)于CLL，且CD22－。
    另一與CLL難于區(qū)分的是FCC，細(xì)胞為強(qiáng)Sig、CD5－、CD10＋、CD23＋，具B系表型：對于診斷為CLL，CD5、FMC7、CD22與SIg，CD20異常強(qiáng)表表達(dá)的病例我們要考慮是否為DLL、MCC或CLL的亞型（trisomy12）因為它們危險性更大。