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    一、 流式細(xì)胞儀在白血病免疫分型診斷的概述

    近年來(lái)白血病的免疫分型已成為診斷血液惡性腫瘤不可缺少的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。早年曾用過(guò)的熒光顯微鏡或APAAP方法基本被廢棄。國(guó)際上公認(rèn)的通用的方法是流式細(xì)胞術(shù)（FCM）。流式細(xì)胞術(shù)白血病免疫分型是利用熒光素標(biāo)記的單克隆抗體（McAb）作分子探針，多參數(shù)分析白血病細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿或細(xì)胞核的免疫表型，由此了解被測(cè)白血病細(xì)胞所屬細(xì)胞系列及其分化程度。

    1. 流式細(xì)胞儀診斷白血病的依據(jù)
    （1）FCM能快速，多參數(shù)，客觀的定性又定量測(cè)定細(xì)胞膜、漿、核的抗原表達(dá)
    （2）至今尚未發(fā)現(xiàn)白血病的特異抗原。
    （3）能用正常血細(xì)胞的單抗來(lái)進(jìn)行免疫分型是基于白血病形成的分化阻斷學(xué)說(shuō)。即白血病細(xì)胞基因異常，分化受阻于某階段形成不同亞型的白血病。這群細(xì)胞充盈于骨髓。正常血細(xì)胞從多能干細(xì)胞分化、發(fā)育、成熟為功能細(xì)胞的過(guò)程中，細(xì)胞膜、細(xì)胞漿或胞核抗原的出現(xiàn)、表達(dá)增多與減少甚至消失與血細(xì)胞的分化發(fā)育階段密切相關(guān)，而且表現(xiàn)出與細(xì)胞系列及其分化程度相關(guān)的特異性。因此，這些抗原的表達(dá)與否可作為鑒別和分類血細(xì)胞的基礎(chǔ)。白血病是造血系統(tǒng)的惡性腫瘤，在形態(tài)上變化雖相當(dāng)大，但仍能表達(dá)正常血細(xì)胞所具有的抗原，因而仍可依據(jù)其抗原的表達(dá)譜對(duì)白血病進(jìn)行免疫分型。

    2. 流式細(xì)胞儀診斷白血病的意義
    （1）骨髓血細(xì)胞是形態(tài)學(xué)分型的基礎(chǔ)，F(xiàn)CM白血病免疫分型是對(duì)形態(tài)學(xué)分型的重要補(bǔ)充和進(jìn)一步深化，國(guó)際白血病MIC分型協(xié)作組認(rèn)為免疫分型對(duì)每一例急性白血病都是必不可少的，對(duì)下列情況意義更大：①用形態(tài)學(xué)、細(xì)胞化學(xué)染色不能肯定細(xì)胞來(lái)源的白血病。②形態(tài)學(xué)為急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）或急性未分化白血病（AUL）但缺乏特異性淋巴細(xì)胞系列抗原標(biāo)記。③混合性白血病。④部分髓系白血病。目前，免疫分型對(duì)粒細(xì)胞和單核細(xì)胞白血病的鑒別尚有一定困難。⑤慢性淋巴細(xì)胞白血病。⑥微小殘留白血病。
    （2）臨床預(yù)測(cè)；可根據(jù)抗原的表達(dá)情況預(yù)測(cè)病情的預(yù)后：如白血病患者有CD7+與CD34+共表達(dá)，預(yù)后不好。
    （3）疾病監(jiān)測(cè)：可監(jiān)測(cè)病程的發(fā)展，療效，可進(jìn)行微小殘留白血病的檢測(cè)。

    二、免疫分型常用的免疫標(biāo)志及其意義

    1.白血病系列分化抗原
    T淋巴細(xì)胞白血病：CD3、CD5、CD7。
    B淋巴細(xì)胞白血?。篊D10、CD19、CD22。
    NK淋巴細(xì)胞白血?。篊D16、CD56、CD57。
    髓系白血?。篊D13、CD14、CD33、MPO（髓過(guò)氧化物酶）。
    紅白血?。篏lyA（血型糖蛋白A）。
    巨核細(xì)胞白血?。篊D41、CD42、CD61。

    2.白血病系列非特異性抗原
    CD34、HLA－DR為早期細(xì)胞抗原，無(wú)系列特異性，可與CD38聯(lián)合運(yùn)用于免疫分型。一般而言，干/祖細(xì)胞CD34＋、HLA－DR＋、CD38－，原始細(xì)胞CD34＋、HLA－DR＋、CD38＋，而幼稚細(xì)胞（如早幼粒細(xì)胞）CD34－、HLA－DR－、CD38＋。

    3.白血病分化階段抗原
    T細(xì)胞抗原CD4、CD8。
    B細(xì)胞抗原：CD10、Cyμ（胞漿μ鏈）、SmIg（表面膜免疫球蛋白）、CD38和CyIg（胞漿免疫球蛋白）、CD11C。

    4.白細(xì)胞共同抗原
    CD45為白細(xì)胞共同抗原，其表達(dá)量在淋巴細(xì)胞最高，單核細(xì)胞，成熟粒細(xì)胞，早期造血細(xì)胞（blasts）依次減弱。紅細(xì)胞（中，晚幼紅細(xì)胞，成熟紅細(xì)胞）不表達(dá)CD45。用SSC/CD45 PerCP雙參數(shù)分析可十分容易鑒別骨髓和血液中的原始或成熟細(xì)胞。用兩個(gè)系列或階段特異性McAb加CD45進(jìn)行三色免疫熒光染色，經(jīng)FSC、SSC、McAbl-FITC、McAb2-PE、CD45 PerCP五參數(shù)分析，可特異地分析原幼白血病細(xì)胞的免疫表型而不受成熟細(xì)胞的干擾。

    三、白血病及淋巴瘤免疫分型

    1.AML
    MO：有低的SSC和FSC。在CD45－SSC圖上出現(xiàn)在淋巴細(xì)胞位置上，至少表達(dá)一個(gè)特異性標(biāo)志如CD13或CD116，但MPO比CD13與CD33更靈敏。一般淋系標(biāo)志陰性，但也可表達(dá)CD7或CD4。一般HLA－DR、CD34陽(yáng)性，有些研究表明CD7與CD34共表達(dá)在AML且預(yù)后差。
    M1：流式上M1與M0相似不易區(qū)分，M1一般CD13＋、CD33＋、HLA－DR－，但CD34表達(dá)少于M0，可能表達(dá)部分CD15。
    M2：M0與M1的主要區(qū)別是成熟度增加，blasts減少，CD15較M1較顯著，CD34弱于M1，CD13有時(shí)表達(dá)強(qiáng)于CD33，多數(shù)病例HLA－DR（-）。CD45－SSC圖顯示從髓系blast區(qū)至成熟骨髓細(xì)胞區(qū)的連續(xù)細(xì)胞帶，CD45－SSC圖有助于確定blasts比例。
    M3：高顆粒性，具較高的SSC，但CD45較成熟C少，多數(shù)情況HLA－DR（-）或表達(dá)減少，CD34少于M2、一般CD13弱（＋），可有CD2表達(dá)。
    M4與M5：兩型表型相似，但M4較M5表達(dá)更多的CD34（＋），較之M0、M1，M4與M5有更大的FSS和SSC，CD45－SSC圖上，成熟C出現(xiàn)在單核區(qū)，重要的表型為CD13、CD33、HLA－DR、CD14和CD15，CD33可表達(dá)強(qiáng)于CD13，CD33（＋）、CD13（－）、CD34（－）很可能為M5，但只出現(xiàn)在少數(shù)病人中，部分M5可見(jiàn)CD56（＋）。
    M6：M6較少見(jiàn)且特征不明顯，一般HLA－DR，CD34、CD13、CD33陽(yáng)性，CD45－SSC圖顯示主要為紅系成份。
    M7：巨核細(xì)胞白血病，在AML中少于1％。一般CD61（GpⅢa）和/或CD41（GpⅡb-Ⅲa）陽(yáng)性，而注意由于血小板粘附在blasts上造成的假陽(yáng)性，可以用流式雙色分析在EDTA存在下，測(cè)GpⅡb/Ⅲa與CD34以減少激活血小板的粘附。

    2.ALL：
    ALL是兒童中最常見(jiàn)的惡性腫瘤，約占全部腫瘤的25％，在成人，ALL約占急性白血病的25％，我們將ALL分為B祖細(xì)胞型，CD10＋或CD10－，前B細(xì)胞型，B細(xì)胞型，T細(xì)胞型。
    B祖細(xì)胞型ALL：
    在幼兒約占ALL的65％～70％，青少年為55％～60％，成人為50％。在兒童，約90％病例CD10＋，在幼兒只有少于50％病例CD10＋，blasts一般FSC、SSC很少，是FAB標(biāo)準(zhǔn)的L1或L2，一般TdT（+）HLA-DR（+），CD19（+），此型又分為2個(gè)亞型，CD10＋和CD10－，前者預(yù)后好，多數(shù)病例CD24＋，CD34＋，CD20表達(dá)隨成熟度增加而增加，B祖細(xì)胞被定義為sIg-。
    前B細(xì)胞型ALL：
    此亞型約占兒童ALL的25％，細(xì)胞一般為CD19＋，CD24，HLA－DR＋，胞漿CD22＋，CD10＋，TdT隨CD20變化，CD34多為陰性，前B亞型被認(rèn)為比B祖型預(yù)后更差，這與t（1；19）出現(xiàn)相關(guān)并由此產(chǎn)生E2A－PBX1融合蛋白，它的表型為CD19＋、CD10＋、CD9＋，不同程度CD20表達(dá)，CD34－，確認(rèn)此表型有助于診斷基因上不確定的病例。
    B細(xì)胞型ALL：
    成熟B細(xì)胞型ALL約占ALL2％～5％，B細(xì)胞型ALL較之B祖細(xì)胞型ALL有更大的FSC和SSC，在CD45－SSC圖上出現(xiàn)在淋巴和單核細(xì)胞區(qū)域，即FAB標(biāo)準(zhǔn)的L3，表型為CD19、CD20、CD22、CD24且sIg（多數(shù)為IGM）多數(shù)病例CD10＋。但成熟抗原及sIg使之區(qū)別于更早的B系A(chǔ)LL，極少數(shù)成熟B細(xì)胞ALL無(wú)FAB－L3形態(tài)。
    T－ALL：多數(shù)病例有大的FSC、SSC，在CD45－SSC圖上可能出現(xiàn)在淋系未成熟細(xì)胞和髓系未成熟細(xì)胞或單核細(xì)胞區(qū)，多數(shù)表現(xiàn)為胸腺亞型，最常見(jiàn)亞型為皮質(zhì)晚期表達(dá)，CD1、CD2、CD5、CD7、CD4/ CD8雙陽(yáng)與極少膜表面CD3、TdT多為陽(yáng)性。另一常見(jiàn)亞型為皮質(zhì)早期表達(dá)CD2、CD5、CD7、TdT強(qiáng)表達(dá)。髓質(zhì)期亞型表達(dá)CD2、CD5、CD7、與CD3＋CD4＋/CD3+CD8+,很少見(jiàn)TdT表達(dá)。前T細(xì)胞亞型，表達(dá)CD7胞漿CD3＋且無(wú)其它T細(xì)胞抗原，T細(xì)胞腫瘤的特征是喪失T細(xì)胞抗原而表現(xiàn)出其它異?？乖M合。
    雜合型白血?。?br />     隨著流式技術(shù)的廣泛應(yīng)用，我們發(fā)現(xiàn)許多病例并不能嚴(yán)格劃分為淋系或髓系，真正的雙表型病人多為t（9；22）或（11q23），現(xiàn)在雜合型的誤診率很高。最常導(dǎo)致誤診的原因是在分析中未能排除非白細(xì)胞，過(guò)度強(qiáng)調(diào)弱的非特異性結(jié)合，忽略了某些抗體缺乏系特異性，最重要的系特異性抗原在B系、T系、髓系分別為CD22、CD3和MPO。

    3.CML：
    由于慢性期顯著的細(xì)胞分化，在CD45－SSC圖上除了髓系細(xì)胞占主導(dǎo)外，只顯示一個(gè)正常骨髓像，CML可確診，CML起病與發(fā)展相對(duì)緩慢，慢性期的持續(xù)1年左右最終發(fā)展為加速期和急變期。流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)急變期亞型的診斷具有極高價(jià)值。直接影響到治療效果。
    急變期CML主要表現(xiàn)為髓系，偶為淋系，髓性急變可表現(xiàn)出多種形態(tài)包括未分化細(xì)胞。淋性急變具典型形態(tài)特征，為CD10＋B祖細(xì)胞ALL極少有T細(xì)胞型ALL。

    4.CLL：
    CLL細(xì)胞主要為較正常淋巴細(xì)胞稍大的小淋巴細(xì)胞。免疫分型主要為：SIgM、SIgD弱表達(dá)，B系抗原為CD19、CD20、CD43、CD79a與CD5共表達(dá)，CD23表達(dá)使得CLL區(qū)別于帽細(xì)胞淋巴癌MU，即（CLL：CD23＋，MCL：CD23－），CD10－、CD23－、CD11c和CD25、CD20常弱表達(dá)，盡管CLL起病慢，但CLL病人的生存率變化很大，有染色體異常的病預(yù)后不良，最常見(jiàn)的三聯(lián)體trisony12、14q、13q、11q，免疫表型上沒(méi)有特異的變化而免疫表型的變化并不是提示染色體異常。最近，有研究表明，三聯(lián)體trisony12與SIg、CD20表達(dá)量高度相關(guān)，與CD23－相關(guān) 與FMC7相關(guān)。
    B型前淋巴細(xì)胞白血?。˙－DLL）較CLL更為嚴(yán)重，流式細(xì)胞技術(shù)在區(qū)分B－DLL和CLL上發(fā)揮很大作用，B－DLL多為CD5－，CD22＋，表達(dá)更強(qiáng)的sig。
    MU病人平均生存率不超過(guò)5年，與CLL在形態(tài)上很難區(qū)分，與CLL相似有CD5＋B祖細(xì)胞，但Sig表達(dá)強(qiáng)于CLL，且CD22－。
    另一與CLL難于區(qū)分的是FCC，細(xì)胞為強(qiáng)Sig、CD5－、CD10＋、CD23＋，具B系表型：對(duì)于診斷為CLL，CD5、FMC7、CD22與SIg，CD20異常強(qiáng)表表達(dá)的病例我們要考慮是否為DLL、MCC或CLL的亞型（trisomy12）因?yàn)樗鼈兾ｋU(xiǎn)性更大。