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    目前，吉非替尼和厄洛替尼等小分子酪氨酸激酶抑制劑（TKI）已被證明是治療晚期非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的有效靶向藥物，并只對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）基因敏感突變類型的肺癌患者才顯示很好療效，肺癌患者在應(yīng)用EGFR-TKI靶向治療前進(jìn)行EGFR基因突變檢測(cè)具有重要臨床意義，而檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性也將直接影響患者靶向治療選擇和療效。本文就肺癌EGFR基因突變的分子病理學(xué)檢測(cè)中主要的質(zhì)量控制和質(zhì)量保證要點(diǎn)進(jìn)行介紹。
 

    1、檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室及人員要求

    常規(guī)EGFR突變檢測(cè)方法基于基因擴(kuò)增技術(shù)之上，其檢測(cè)應(yīng)嚴(yán)格在基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)室包括試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)等4個(gè)區(qū)。因肺癌EGFR檢測(cè)的標(biāo)本多為石蠟包埋的組織蠟塊，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)設(shè)置***的標(biāo)本制備預(yù)處理區(qū)（切片區(qū)），嚴(yán)防標(biāo)本在制片過程中被污染。各工作分區(qū)應(yīng)標(biāo)識(shí)清晰，儀器設(shè)備應(yīng)滿足檢測(cè)要求，各工作區(qū)專用的儀器設(shè)備、辦公用品、工作服、實(shí)驗(yàn)耗材和清潔用具等不可混用。檢測(cè)過程中嚴(yán)格質(zhì)量控制，實(shí)驗(yàn)完畢后做好清潔消毒工作。

    分子病理學(xué)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）實(shí)驗(yàn)室工作人員應(yīng)參加我國(guó)衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)指定的機(jī)構(gòu)舉辦的技術(shù)培訓(xùn)后取得合格證，并定期進(jìn)行培訓(xùn)。

    2、EGFR突變檢測(cè)的標(biāo)本要求

    需要進(jìn)行EGFR-TKI靶向治療的患者應(yīng)進(jìn)行EGFR基因突變篩選；臨床標(biāo)準(zhǔn)（女性，無吸煙史等）不能決定是否進(jìn)行檢測(cè)；有研究表明，免疫組織化學(xué)染色（IHC）檢出總EGFR蛋白表達(dá)也不推薦TKI治療篩選。

    EGFR突變檢測(cè)，對(duì)肺癌部分切除標(biāo)本建議用于腺癌和含腺癌成分的混合型肺癌，不考慮組織學(xué)分級(jí)；對(duì)肺癌全切標(biāo)本，不建議用于無任何腺癌成分的肺癌，例如純鱗癌、純小細(xì)胞癌或IHC未顯示腺癌分化的大細(xì)胞癌；對(duì)小標(biāo)本（活檢、細(xì)胞學(xué)標(biāo)本），如果不能完全除外腺癌，可檢測(cè)組織學(xué)表現(xiàn)為鱗癌或小細(xì)胞癌的標(biāo)本檢測(cè)，但應(yīng)結(jié)合臨床標(biāo)準(zhǔn)（年輕患者、無吸煙史）協(xié)助篩選；對(duì)初治患者，檢測(cè)原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶；對(duì)于多發(fā)性原發(fā)肺腺癌，可分別檢測(cè)，但不必對(duì)同一腫瘤多個(gè)區(qū)域檢測(cè)。

    在確定EGFR-TKI治療的進(jìn)展期（Ⅳ期）肺癌患者，或低期別患者發(fā)生復(fù)發(fā)或進(jìn)展（原先未進(jìn)行檢測(cè)）時(shí)，應(yīng)行EGFR突變檢測(cè)。由于肺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高，對(duì)Ⅰ~Ⅲ期肺癌，在診斷時(shí)鼓勵(lì)患者進(jìn)行檢測(cè)，以便出現(xiàn)復(fù)發(fā)時(shí)及時(shí)治療，但應(yīng)視具體情況決定。

    3、EGFR突變檢測(cè)流程

    標(biāo)本處理手術(shù)或活檢組織標(biāo)本應(yīng)在離體30分鐘內(nèi)用10%中性福爾馬林固定，避免用酸性、重金屬固定液或脫鈣液等處理；活檢小標(biāo)本固定6~24小時(shí)，手術(shù)切除大標(biāo)本固定8~48小時(shí)；細(xì)胞學(xué)標(biāo)本可用于EGFR突變檢測(cè)，細(xì)胞石蠟包埋塊優(yōu)于細(xì)胞涂片。

    標(biāo)本評(píng)估及DNA提取對(duì)檢測(cè)標(biāo)本進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)評(píng)估是EGFR檢測(cè)最重要的質(zhì)量控制之一，病理醫(yī)生首先應(yīng)評(píng)估整個(gè)樣本中腫瘤細(xì)胞含量（腫瘤細(xì)胞百分比），確定標(biāo)本是否滿足檢測(cè)要求（所采用檢測(cè)方法的敏感性），必要時(shí)進(jìn)行微切割富集腫瘤，EGFR突變檢測(cè)標(biāo)本使用的切片機(jī)刀架座須清潔并消毒，不同標(biāo)本切片時(shí)要更換刀片；制備3~10張厚8μm組織切片，對(duì)照HE染色結(jié)果刮取腫瘤細(xì)胞豐富區(qū)域，避開非腫瘤區(qū)和壞死區(qū)等；采用標(biāo)準(zhǔn)試劑盒提取基因組DNA，并測(cè)定DNA濃度。

    EGFR突變檢測(cè)EGFR突變檢測(cè)方法有很多種，應(yīng)結(jié)合檢測(cè)標(biāo)本特點(diǎn)來判斷是否進(jìn)行檢測(cè)。最傳統(tǒng)的直接測(cè)序法（Sanger測(cè)序）可得到序列的直接信息，對(duì)未知突變的檢出具有優(yōu)勢(shì)，是直接有效地檢測(cè)基因突變狀態(tài)的方法，但敏感性較低，實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間長(zhǎng)、步驟復(fù)雜、易污染。

    以實(shí)時(shí)定量PCR（RT-PCR）為平臺(tái)的突變檢測(cè)技術(shù)，均須根據(jù)已知的突變類型設(shè)計(jì)引物和探針，因此無法檢測(cè)出所有可能的突變，但敏感性較直接測(cè)序法高，操作簡(jiǎn)單，不必對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行操作，很大程度避免了擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。

    實(shí)驗(yàn)室應(yīng)采用能在至少含50%腫瘤細(xì)胞的標(biāo)本中檢測(cè)到突變的方法。推薦采用更敏感的方法，至少能在含10%腫瘤細(xì)胞的標(biāo)本中檢測(cè)到突變，但不可一味追求高敏感性，而忽視對(duì)特異性和準(zhǔn)確性的考量。

    另外，不同實(shí)驗(yàn)條件、不同樣本中檢測(cè)的最適方法也可能不同，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況選擇適合的EGFR基因突變檢測(cè)方法，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證所采用方法的準(zhǔn)確性和敏感性，無論采用何種檢測(cè)方法，臨床EGFR基因突變檢測(cè)應(yīng)能檢測(cè)所有突變頻率在1%以上的突變類型。

    EGFR突變檢測(cè)結(jié)果分析與報(bào)告EGFR突變檢測(cè)根據(jù)各自檢測(cè)方法的判讀標(biāo)準(zhǔn)分析檢測(cè)結(jié)果。測(cè)序法檢測(cè)EGFR基因突變，成功的峰形圖的峰形規(guī)則，如圖1，RT-PCR法檢測(cè)EGFR基因突變結(jié)果如圖2所示；如果檢測(cè)結(jié)果可疑（圖3，4），應(yīng)重復(fù)進(jìn)行檢測(cè)或采用其他的檢測(cè)方法驗(yàn)證。

    EGFR突變檢測(cè)報(bào)告須包括結(jié)果和說明，報(bào)告內(nèi)容應(yīng)讓腫瘤醫(yī)生和其他病理醫(yī)生易于理解，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室收到標(biāo)本后2周（10個(gè)工作日）內(nèi)簽發(fā)報(bào)告，平均檢測(cè)周期＞2周的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有措施（自身或第3方實(shí)驗(yàn)室）來保證緊急病例能更快得到檢測(cè)結(jié)果。

    4、EGFR突變檢測(cè)的其他質(zhì)量控制與質(zhì)量保證

    分子檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室人員應(yīng)嚴(yán)格按照已經(jīng)驗(yàn)證的標(biāo)準(zhǔn)化操作流程進(jìn)行EGFR檢測(cè)，EGFR突變檢測(cè)驗(yàn)證應(yīng)與其他分子診斷相同，每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰性和陽(yáng)性質(zhì)控，定期總結(jié)檢測(cè)結(jié)果，及時(shí)發(fā)現(xiàn)并解決問題。

    實(shí)驗(yàn)室每月采用不同的檢測(cè)平臺(tái)驗(yàn)證一定數(shù)量的EGFR基因突變檢測(cè)結(jié)果，每年應(yīng)至少參加兩次單項(xiàng)能力驗(yàn)證（室間質(zhì)控）。

    驗(yàn)證機(jī)構(gòu)有我國(guó)衛(wèi)生計(jì)生委病理質(zhì)控中心（PQCC），國(guó)際機(jī)構(gòu)如美國(guó)病理學(xué)家學(xué)會(huì)（CAP），歐洲分子基因診斷質(zhì)量聯(lián)盟（EMQN）等。

    2013年肺癌相關(guān)研究：（按照時(shí)間順序）
    部分非小細(xì)胞肺癌無需行系統(tǒng)性淋巴結(jié)清掃術(shù)
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