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    染色體非整倍體異常是指細(xì)胞中個別染色體的增多或減少形成的染色體數(shù)目異常。產(chǎn)前診斷中最常見的胎兒非整倍體異常有21-三體、13-三體、18-三體以及性染色體綜合征等。染色體整倍體改變多導(dǎo)致流產(chǎn)，而非整倍體改變可以出生能存活的出生缺陷兒。因此，檢測胎兒非整倍體異常是許多孕婦接受產(chǎn)前診斷的主要原因。傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷措施是采用侵入性方法獲取胎兒物質(zhì)，如絨毛取樣、羊水穿刺和胎兒臍靜脈穿刺等，這些操作會給胎兒帶來一定的風(fēng)險。

    1969年Walknowska等在懷男胎的孕婦血液循環(huán)中發(fā)現(xiàn)了46，XY的中期分裂相，因此提出母血中可能存在著胎兒細(xì)胞。這一觀點(diǎn)引起了人們對無創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷的興趣。研究者希望從母血中富集胎兒細(xì)胞獲得胎兒染色體信息，由于母體循環(huán)中的胎兒細(xì)胞數(shù)量稀少，細(xì)胞的富集過程既復(fù)雜且價格昂貴，所以至今尚不能應(yīng)用于臨床。1997年，Lo等在孕婦的血漿和血清中檢出了游離的胎兒DNA。2000年P(guān)oon等在孕有男胎的孕婦血漿中首次發(fā)現(xiàn)Y染色體特異的RNA，這些發(fā)現(xiàn)為無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷胎兒染色體異常開創(chuàng)了一個新的研究領(lǐng)域。本文就無創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷胎兒染色體非整倍體的研究及其進(jìn)展進(jìn)行簡要綜述。

    一、利用孕婦外周血中胎兒細(xì)胞診斷胎兒非整倍體異常

    利用孕婦外周血中胎兒細(xì)胞產(chǎn)前診斷胎兒非整倍體異常，其主要優(yōu)勢在于分離提取的胎兒細(xì)胞所提供的是純凈的胎兒核酸，含有完整的胎兒基因組DNA，因此能夠進(jìn)行完整的胎兒染色體核型分析。這是孕婦外周血中胎兒游離DNA或游離RNA所無法比擬的。已發(fā)現(xiàn)的孕婦外周血中胎兒細(xì)胞主要有滋養(yǎng)細(xì)胞、胎兒有核紅細(xì)胞（nucleated red blood cell，NRBC）、淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞等。近年還發(fā)現(xiàn)一種類似于干細(xì)胞的胎兒細(xì)胞存在于孕婦外周血中。目前為止研究較多的是NRBC。相對其他細(xì)胞來說，NRBC是單核細(xì)胞，壽命短且穩(wěn)定，增殖能力有限，不能滯留到下次妊娠。另外，NRBC有明顯形態(tài)學(xué)特點(diǎn)和特殊的細(xì)胞表面標(biāo)志物，易于識別。因此 NRBC被認(rèn)為是理想的無創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷的靶細(xì)胞而受到較多的關(guān)注。

    1991年，Price首次應(yīng)用18號染色體特異性探針對母血中胎兒細(xì)胞進(jìn)行檢測，診斷出1例18-三體胎兒。Bischoff等采集40例孕婦外周血，以抗CD71和CD45單抗標(biāo)記NRBC，用流式細(xì)胞儀分離胎兒細(xì)胞，以 X、Y、13、18和21號染色體特異性探針進(jìn)行熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH），準(zhǔn)確測定出2例21-三體的胎兒。另外也有研究者報道通過FISH方法檢測出21-三體綜合征、13-三體綜合征和18-三體綜合征等染色體非整倍體病例，并且有較低的假陽性率。

    為了評價利用孕婦外周血中胎兒細(xì)胞進(jìn)行非侵入性產(chǎn)前診斷或篩查胎兒染色體異常是否可以應(yīng)用于臨床，由美國**衛(wèi)生研究院支持，美國兒童健康和發(fā)展研究院（nationalinstitute of child health and development，NICHD）發(fā)起了一個大規(guī)模的臨床研究，由Bianchi等共收集了6個中心2 744例樣本，采用磁性激活細(xì)胞分選法（magnetic activated cell sorting，MACS）或熒光激活細(xì)胞分離技術(shù)（fluorescence activated cellsorting，F(xiàn)ACS）富集胎兒細(xì)胞，并用FISH方法檢測獲得的單胎男性胎兒間期細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MACS和FACS分離富集胎兒細(xì)胞的效率分別為44%和13%，與羊水或絨毛核型分析相比對胎兒染色體非整倍體異常檢測的敏感性為60%。表明胎兒細(xì)胞可用來診斷胎兒非整倍體，但尚不能滿足臨床應(yīng)用的要求。

    影響胎兒細(xì)胞應(yīng)用于臨床診斷的因素首先是富集效率低，能獲得的胎兒細(xì)胞數(shù)量太少。也有研究發(fā)現(xiàn)孕婦外周血中NRBC不只是來自胎兒，也含有母源細(xì)胞。Troeger等利用Y染色體特異標(biāo)志物和RhD基因?qū)Ω患降挠泻思t細(xì)胞進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)孕婦外周血中NRBC僅大約50%為胎兒源性。因此，在利用NRBC進(jìn)行非創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷時，須對分離到的NRBC來源進(jìn)行鑒定，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

    在對分離到的胎兒NRBC進(jìn)行染色體分析時，F(xiàn)ISH是最常用的方法。巴塞爾實驗室的研究發(fā)現(xiàn)，對鑒定后的NRBC，采用FISH方法時，大多數(shù)細(xì)胞難以進(jìn)行熒光標(biāo)記。這可能是由于母體循環(huán)中的胎兒細(xì)胞具有凋亡特征，細(xì)胞核的密度增高以及這些胎兒細(xì)胞從相對低氧的胎兒環(huán)境進(jìn)入到富氧的母體循環(huán)，細(xì)胞受到影響的原因。而且在FISH結(jié)果分析中，研究者必須目測篩選成百上千個分裂間期核，勞動強(qiáng)度高，并帶有主觀性。這些因素都影響了孕婦外周血中胎兒NRBC在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用。

    盡管如此，圍繞著利用胎兒細(xì)胞進(jìn)行無創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷的工作仍然在不斷地探索中。策略之一是尋找新的胎兒NRBC特異性標(biāo)志物。另外，改進(jìn)或選擇新的胎兒NRBC的富集方法和分選技術(shù)也是研究的方向。如使用合適的重量克分子滲透壓濃度結(jié)合二倍密度梯度離心法可大幅度提高胎兒NRBC富集效率。Huang等使用微流體磁化方法分離NRBC，可將分離率提高10～20倍，采用散射光譜技術(shù)能夠提高鑒別胎兒NRBC的能力?；贔ISH掃描的自動化顯微操縱技術(shù)用于檢測早、中期妊娠母血標(biāo)本也顯示出良好的應(yīng)用前景。類似于干細(xì)胞的胎兒細(xì)胞被認(rèn)為可能適宜進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，如果孕婦外周血中胎兒細(xì)胞能夠培養(yǎng)成功，可以獲得足夠的用于核型分析的胎兒細(xì)胞，再結(jié)合改進(jìn)的FISH技術(shù)，如光譜核型分析（spectral karyotyping，SKY），可能使得非侵入性產(chǎn)前診斷胎兒非整倍體出現(xiàn)突破性進(jìn)展。

    二、利用孕婦血漿中細(xì)胞游離胎兒DNA檢測胎兒非整倍體

    自1997年Lo等在孕婦血漿和血清中檢出游離胎兒DNA以后，關(guān)于游離胎兒DNA的臨床應(yīng)用研究受到許多關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn)懷有染色體非整倍體胎兒的孕婦，其血漿或血清中胎兒游離DNA濃度高于懷有正常胎兒的孕婦，但是在部分正常和非正常妊娠之間胎兒游離DNA濃度存在重疊。另外，在孕11～17周，胎兒DNA平均含量僅占孕婦血漿中細(xì)胞游離總DNA含量的大約3%。母源性游離DNA占絕對優(yōu)勢，這就意味著使用傳統(tǒng)的DNA提取技術(shù)和熒光定量PCR方法難以對胎兒染色體非整倍體異常進(jìn)行準(zhǔn)確診斷。

    解決這一問題的途徑之一是可以通過改進(jìn)提取方法，增加提取的胎兒DNA的濃度或抑制母體DNA濃度，減少背景DNA。有研究表明，母血循環(huán)中胎兒DNA分子一般比母體DNA分子要短，絕大部分小于313 bp。Deng等報道，擴(kuò)增片段長度在180 bp以下的Y特異的短串聯(lián)重復(fù)序列，可以提高胎兒等位基因的檢出率。Jorgez等利用凝膠電泳方法選擇性回收母血中不同大小片段DNA，結(jié)合全基因組掃描分析，發(fā)現(xiàn)回收100～300 bp范圍的片段，可以獲得更多的細(xì)胞游離胎兒DNA。Dhallan等認(rèn)為在抗凝的外周血中加入少量10%甲醛可減少母體血液中白細(xì)胞裂解，從而增加游離胎兒DNA在母體DNA中比例。但是一些研究結(jié)果不支持這一觀點(diǎn)。

    克服上述不足的另一個途徑是尋找孕婦外周血中新的胎兒特異性標(biāo)志物，使之能夠像檢測Y特異序列或RhD血型一樣，不受高濃度母體背景DNA的影響。近年來表觀遺傳學(xué)的研究為這一設(shè)想提供了可能。表觀遺傳是指DNA序列不發(fā)生變化但基因表達(dá)卻發(fā)生了可遺傳的改變。DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)也是最重要的基因表觀修飾方式之一。DNA甲基化是在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下使CpG二核苷酸 5′端的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?5′甲基胞嘧啶。這種 DNA修飾方式并沒有改變基因序列，但是它調(diào)控了基因的表達(dá)。一般情況下，DNA甲基化能關(guān)閉某些基因的活性，去甲基化則誘導(dǎo)了基因的重新活化和表達(dá)。

    2002年P(guān)oon等利用甲基化特異性 PCR方法，不僅從母血漿中檢測到胎兒從父系繼承下來的甲基化等位基因，還檢測到從母系繼承來的胎兒非甲基化等位基因，說明胎兒與母體之間的基因位點(diǎn)上存在不同的甲基化形式。這一結(jié)果為無創(chuàng)傷性診斷胎兒非整倍體提供了依據(jù)。Chim等研究顯示，編碼maspin 基因的SERPINB5基因，在胎盤細(xì)胞中處于低甲基化，而在母血細(xì)胞中處于高甲基化。因為胎盤是血漿中游離胎兒DNA的主要來源，而母血細(xì)胞是血漿中母體DNA的主要來源，推測利用胎兒和母血細(xì)胞之間存在的DNA甲基化狀態(tài)的差異，可以進(jìn)行胎兒非整倍體的檢測。而maspin 基因位于18號染色體，因此可以通過檢測maspin 基因的甲基化情況，診斷胎兒18-三體。

    在此研究思路下，Tong等應(yīng)用表觀遺傳學(xué)等位基因比率（epigenetic allelic ration，EAR）分析方法，利用maspin 基因啟動子區(qū)域內(nèi)的一個雜合性SNP位點(diǎn)（A/C），進(jìn)行等位基因定量分析。發(fā)現(xiàn)妊娠有該雜合SNP 位點(diǎn)正常二倍體胎兒的孕婦，外周血中兩種低甲基化的maspin等位基因的比率為1∶1，而妊娠18-三體綜合征胎兒的孕婦，外周血中兩種低甲基化的maspin等位基因的比率為1∶2或2∶1，從而證明聯(lián)合利用此差異性甲基化位點(diǎn)和位于此位點(diǎn)的SNP位點(diǎn)，可以進(jìn)行胎兒18-三體的無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷。但是，這種方法也有明顯的不足，一個限制就是母親必須是C/C純合子，胎盤的基因型必須是A/C雜合子，但這種變異很少見，或許還存在種族差異，比如在129例高加索人的胎盤中未發(fā)現(xiàn)C等位基因。另外也有一個技術(shù)問題就是甲基化特異性 PCR過程中使用的重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)換步驟，能夠?qū)е卤緛砭秃苌俚奶篋NA模板被大量破壞，這將嚴(yán)重妨礙試驗的效果。因此，有必要探索更恰當(dāng)?shù)脑囼灧椒ɑ虿呗浴?br />
    唐氏綜合征由于其發(fā)病率高而備受關(guān)注，為了尋找21號染色體的表觀遺傳標(biāo)記，Hultén等采取了3種策略進(jìn)行篩選，結(jié)果在21q22.3發(fā)現(xiàn)了3個差異甲基化序列。其中AIRE基因啟動子區(qū)域的CpG位點(diǎn)高度差異甲基化，可作為無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷唐氏綜合征重要的候選表觀遺傳標(biāo)記。Chim等采用甲基化敏感的單核甘酸引物延伸和（或）重亞硫酸鹽測序的方法，系統(tǒng)性搜尋21號染色體上的甲基化位點(diǎn)，在114個CpG島中，有22個顯示出母體和胎兒間的表觀遺傳學(xué)差異。隨著這些表觀遺傳標(biāo)記研究的不斷深入，有可能使無創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷胎兒染色體非整倍體成為現(xiàn)實。

    三、利用孕婦血漿中細(xì)胞游離胎兒mRNA檢測胎兒非整倍體

    2000年 Poon等在孕有男胎的孕婦血漿中首次檢測到 Y染色體特異性鋅脂蛋白（**Y）mRNA。此后許多研究證實了孕婦外周血中存在著游離胎兒RNA。這些游離胎兒RNA主要來自胎盤，在孕婦血漿中含量豐富，具有極好的穩(wěn)定性，并且與血漿中胎兒DNA一樣，于產(chǎn)后迅速從血漿中清除。這些特性顯示了利用孕婦外周血中游離RNA檢測胎兒異常是可行的。Lo等報道了測定胎盤特異性因子4（placental-specific 4，PLAC4）基因表達(dá)產(chǎn)物診斷胎兒非整倍體的研究結(jié)果。PLAC4基因來自胎盤，僅在胎盤表達(dá)，具有胎兒特異性。該基因定位于21號染色體，因此，Lo等推測定量分析孕婦血漿中PLAC4 mRNA可以用于診斷胎兒21-三體綜合征。

    由于普通的熒光定量難以滿足檢測要求，Lo等利用堿基延伸反應(yīng)和基質(zhì)輔助激光解吸附/電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）檢測PLAC4 mRNA。他們選擇了PLAC4基因內(nèi)的SNP雜合位點(diǎn)進(jìn)行等位基因比率定量分析。在正常二倍體，PLAC4 mRNA轉(zhuǎn)錄的每一個等位基因量是相等的，其比率應(yīng)為1∶1；而在非整倍體，如21-三體，其比率將是2∶1或1∶2。Lo等檢測了10例21-三體的胎兒，結(jié)果顯示診斷的敏感性為90%，特異性為96%。在57例對照中正確判斷了55例正常二倍體，該研究雖然例數(shù)不多，但是很有意義，表明了一種無創(chuàng)傷性診斷胎兒非整倍體的新的策略方法。該方法的不足之處在于受檢胎兒的SNP位點(diǎn)必須是雜合子，這種基因型只出現(xiàn)于大約50%的被檢者，因此必須發(fā)現(xiàn)更多的SNP位點(diǎn)，或者增加21號染色體特異的細(xì)胞游離胎兒RNA的種類。胎兒基因表達(dá)譜的研究將有助于這項工作的進(jìn)一步開展。Tsui等用同樣的RNA-SNP等位基因比率分析方法檢測母血漿中胎盤特異的SERPINB2基因轉(zhuǎn)錄的 mRNA，檢測出18三體異常。

    由于MALDI-TOF MS檢測方法的局限性，Lo等將數(shù)字PCR用于RNA-SNP的檢測，該方法可以準(zhǔn)確計數(shù)出微量的模板拷貝數(shù)變化，這項技術(shù)優(yōu)于質(zhì)譜之處在于胎兒不必是SNP位點(diǎn)的雜合子，對純合子胎兒也可以檢測，不僅簡化了操作，而且擴(kuò)大了應(yīng)用范圍，提高了檢測的有效性和準(zhǔn)確性。Go等[39]將淬滅延伸反應(yīng)和部分變性高效液相色譜應(yīng)用于RNA SNP方法 成功檢測出21-三體胎兒，使得RNA SNP方法不必依賴于昂貴的MALDI-TOF MS設(shè)備。

    選擇細(xì)胞游離胎兒RNA進(jìn)行無創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷的主要優(yōu)勢在于基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的多拷貝性。另一個優(yōu)勢是胎盤表達(dá)的特異的mRNA種類是母體任何組織都不表達(dá)的，易于檢測，與前述的利用表觀遺傳學(xué)差異選擇胎兒特異的標(biāo)記物一樣，分析胎盤來源的RNA類似利用胎兒DNA檢測Y特異序列或RhD血型，母體血漿中完全缺乏這種物質(zhì)，因此檢測不受強(qiáng)大的母體DNA背景的干擾。

    四、結(jié)語

    每年有成百萬孕婦需要接受胎兒染色體異常的產(chǎn)前篩查，高風(fēng)險的孕婦要面對侵入性診斷所帶來的壓力，而無創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷為她們提供了一種理想的、對胎兒無風(fēng)險的診斷途徑。雖然利用孕婦血漿中胎兒DNA檢測Y染色體特異序列以及RhD血型已經(jīng)常規(guī)應(yīng)用于臨床。但是對胎兒非整倍體異常的無創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷仍然存在著檢測效率低、實驗過程復(fù)雜、研究的樣本量小等不足，因此目前尚不能滿足臨床應(yīng)用的要求。然而，隨著孕婦外周血中胎兒物質(zhì)富集技術(shù)的提高、新的檢測方法的應(yīng)用、多中心研究的開展以及診斷策略的完善，這項技術(shù)將最終能夠成為具有臨床價值的檢測方法。（無創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷胎兒染色體非整倍體的研究進(jìn)展 劉福民）