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    原位雜交技術(shù)的基本方法包括：
    ①雜交前準(zhǔn)備：包括固定、取材、玻片和組織的處理，如何增強(qiáng)核酸探針的穿透性、減低背景染色等；
    ②雜交；
    ③雜交后處理；
    ④顯示：包括放射自顯影和非放射性標(biāo)記的組織化學(xué)或免疫組織化學(xué)顯色。

    一、固定

    原位雜交固定的目的是為了保持細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，最大限度地保存細(xì)胞內(nèi)的DNA或RNA的水平；使探針易于進(jìn)入細(xì)胞或組織。DNA是比較穩(wěn)定的，mRNA是相對穩(wěn)定的但易為酶合成和降解。為了減少RNA被酶降解，取材后應(yīng)盡快冷凍或固定。
    1、最常用多聚甲醛固定組織，因其不會(huì)與蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交叉連接，不會(huì)影響探針穿透入細(xì)胞或組織。
    2、醋酸-酒精的混合液和Bouin固定劑也能獲得較滿意的效果。
    3、mRNA的定位將組織固定于4%多聚甲醛磷酸緩沖液中1-2h，在冷凍前浸入15%蔗糖溶液中，置4℃冰箱過液，次日切片或保存在液氮中。
    4、組織也可在取材后直接置入液氮冷凍，切片后才將其浸入4%多聚甲醛約10min，空氣干燥后保存在-70℃。如冰箱溫度恒定，在-70℃切片可保存數(shù)月之久不會(huì)影響雜交結(jié)果。在病理學(xué)活檢取材時(shí)多用福爾馬林固定和石蠟包埋，這種標(biāo)本對檢測DNA和mRNA有時(shí)也可獲得雜交信號，但石蠟包埋切片由于與蛋白質(zhì)交聯(lián)的增加，影響核酸探針的穿透，因而雜交信號常低于冰凍切片。同時(shí)，在包埋的過程中可減低mRNA的含量。

    二、玻片和組織切片的處理

    1、玻片的處理
    玻片包括蓋片和載玻片應(yīng)用熱肥皂水刷洗，自來水清洗趕緊后，置于清潔液浸泡24h，清水洗凈烘干，95%酒精中浸泡24h后蒸餾水沖洗、烘干、烘箱溫度最好在150℃或以上過液以去除任何RNA酶。蓋玻片最好用硅化處理，錫箔包裹無塵存放。
    載玻片最好用硅化玻片，也用多聚賴氨酸液或APES膠處理。

    2、增強(qiáng)組織的通透性和核酸探針的穿透性
    增強(qiáng)組織通透性常用的方法如應(yīng)用稀釋的Triton X100（又稱去垢劑或清洗劑），用消化酶如蛋白酶K，胃蛋白酶、胰蛋白酶、膠原蛋白酶、淀粉酶等處理。

    3、減低背景染色
    背景染色的形成是諸多因素構(gòu)成的。雜交后的酶處理和雜交后用去垢劑洗滌均有助于減低背景染色。在多聚甲醛固定后，浸入乙酰酐和三乙醇胺中以減低靜電效應(yīng)，減少探針對組織的非異性背景染色。
    預(yù)雜交也是減低背景染色的一種有效手段。預(yù)雜交液和雜交液的區(qū)別在于前者不含探針和硫酸葡聚糖。將組織切片浸入預(yù)雜交液中可達(dá)到封閉非特性雜交點(diǎn)的目的，從而減低背景染色。
    在雜交后洗滌中采用低濃度的RNA酶溶液（20μg/ml）洗滌一次，減少殘留的內(nèi)源性的RNA，降低背景染色。

    4、防止RNA酶的污染
    由于在手指皮膚及實(shí)驗(yàn)用玻璃皿上均可能有RNA酶，為防止其污染影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，在整體雜交前處理過程都需戴消毒手套。所有實(shí)驗(yàn)用玻璃器皿及鑷子都應(yīng)于實(shí)驗(yàn)前一日置高溫（240℃）烘烤以消除RNA酶。

    三、雜交

    雜交是將雜交液滴于切片組織上，加蓋硅化的蓋玻片，防止孵育過程中雜交液的蒸發(fā)。在蓋玻片周圍加液體石蠟封固或加橡皮泥封固。（硅化的蓋玻片的優(yōu)點(diǎn)是不會(huì)產(chǎn)生氣泡和影響組織切片與雜交液的接觸）。

    四、雜交后處理

    雜交后處理包括系列不同濃度，不同溫度鹽溶液的漂洗。

    雜交后，用RNA酶液來洗滌，能將組織切片中非堿基配對RNA除去。遵循的原則是鹽溶液濃度由高到低而溫度由低到高，在漂洗的過程中，切片不能干燥。干燥的切片使大量的非特異性結(jié)合無法洗去。

    五、檢測系統(tǒng)

    根據(jù)核酸探針標(biāo)記物的種類分別進(jìn)行放射自顯影或利用酶檢測系統(tǒng)進(jìn)行不同顯色處理。

    六、對照實(shí)驗(yàn)和結(jié)果的判斷

    對照試驗(yàn)的設(shè)置須根據(jù)核酸探針和靶核苷酸的種類和現(xiàn)有的可能條件去選定，常用的對照試驗(yàn)有下列幾種。
    1、將cDNA或cRNA探針進(jìn)行預(yù)雜交（吸收試驗(yàn)）。
    2、將非特異性（載體）序列和不相關(guān)探針雜交（置換試驗(yàn)）。
    3、將切片應(yīng)用RNA酶或DNA酶進(jìn)行預(yù)處理后雜交。應(yīng)用同義RNA（sense probe）進(jìn)行雜交。
    4、以下不加核酸探針雜交液進(jìn)行雜交（空白試驗(yàn)）。
    5、組織對照已知確定為陽性或陰性組織進(jìn)行雜交對照。
    6、應(yīng)用未標(biāo)記探針做雜交進(jìn)行對照。