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【PDF】蛋白質(zhì)純化實(shí)驗(yàn)參考手冊(cè) - 醫(yī)學(xué)資源下載

2013-07-27 05:00 閱讀:403 來(lái)源:愛愛醫(yī) 責(zé)任編輯:愛愛醫(yī)資源網(wǎng)
[導(dǎo)讀] 【PDF】蛋白質(zhì)純化實(shí)驗(yàn)參考手冊(cè) - 醫(yī)學(xué)資源下載 資源作者:deyixu 資源分類:醫(yī)學(xué) - 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué) 資源屬性:電子書 資源售價(jià):1 愛醫(yī)幣 資源大?。?.26M 關(guān)注入數(shù):359 人次 評(píng)論人數(shù)
【PDF】蛋白質(zhì)純化實(shí)驗(yàn)參考手冊(cè) - 醫(yī)學(xué)資源下載
資源作者:deyixu
資源分類:醫(yī)學(xué) - 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)
資源屬性:電子書
資源售價(jià):1 愛醫(yī)幣
資源大小:0.26M
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上傳日期:2012-10-22 08:07:20
蛋白質(zhì)純化實(shí)驗(yàn)參考手冊(cè).pdf 第一章 外源基因在大腸桿菌中的表達(dá) 一、通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)將靶基因亞克隆到質(zhì)粒載體上 (一)PCR 引物設(shè)計(jì)的基本原則與 PCR 反應(yīng)組分和條件 1. PCR 引物設(shè)計(jì)的基本原則 (1)引物與靶基因間配對(duì)的堿基一般為 1520 。 (2)引物堿基盡可能隨機(jī)分布,避免出現(xiàn)嘌呤、嘧啶堆積現(xiàn)象,引物 G + C 含量 宜在 4555% 左右。 (3)引物內(nèi)部不應(yīng)形成二級(jí)結(jié)構(gòu),兩個(gè)引物之間尤其在 3’末端不應(yīng)有互補(bǔ)鏈存在。 (4)引物的堿基順序不應(yīng)與非擴(kuò)增區(qū)域有同源性??捎糜?jì)算機(jī)進(jìn)行輔助檢索分析。 (5)引物 3’末端一般以單個(gè) C 或 G 結(jié)尾。 2. PCR 反應(yīng)組分和條件 PCR 反應(yīng)體系一般選用 50 μl 體積,其中含有: 10×Reaction buffer,5 μl 2 個(gè)引物,各 12.525 pmol (終濃度各 0.250.50 μmol/L) 4 種底物(dATP + dCTP + dGTP + dTTP),各 200μmol/L 模板 DNA,100 ng 左右 Taq DNA 聚合酶,2.53 U PCR 反應(yīng)條件一般為: (1)94℃,5 分鐘 (2)94℃變性 3060 秒 (3)5055℃ 退火 3060 秒 (4)7072℃ 延伸 3060 秒 (5)72℃ 5 10 分鐘 共進(jìn)行 2535 次循環(huán)。循環(huán)是步驟(2)和(4) (二) 質(zhì)粒 DNA 的小量制備 3 1、傳統(tǒng)方法 (1)用滅菌牙簽挑單菌落于 3 ml LB 培養(yǎng)液中,37℃培養(yǎng)過(guò)夜。 (2)在每個(gè) EP 管中倒入 1 ml 左右的過(guò)夜培養(yǎng)物,6,000 rpm 離心 1 分鐘以收集 菌體。 (3)將菌體重懸于 100 μl 4℃預(yù)冷的溶液 I 中,并加入 200 μl 新配制的溶液 II, 蓋 緊管口,快速顛倒離心管 67 次,然后,冰浴 5 分鐘。 (4)加 150 μl 4℃預(yù)冷的溶液 III, 倒置 56 次以混合內(nèi)容物,然后,冰浴 5 分鐘。 (5)12,000 rpm 離心 10 分鐘后,小心吸取上清至另一 EP 管中。 (6)加 2 倍體積的無(wú)水乙醇,振蕩混合,并在室溫放置 5 分鐘。 (7)12,000 rpm 離心 5 分鐘后,移去上清,并用 70%乙醇漂洗 DNA 沉淀。DNA 沉淀自然干燥,并溶于 20 μl 雙蒸水或 1×TE 緩沖液 (10 mmol/L Tris, 1 mmol/L EDTA, pH 8.0) 中。 2. Promega 公司 Wizard Plus 小量 DNA 純化方法 離心方案(適用于產(chǎn)品 A1330, A1340,A1460 及 A1470) (1)12,000 rpm 離心 1 分鐘,以沉淀 110 ml 過(guò)夜培養(yǎng)物。 (2)用 250μl Cell Resuspension Solution 充分懸浮大腸桿菌細(xì)胞。 (3)加 250μl Cell Lysis Solution,倒置 56 次混合。 (4)加 10μl Alkaline Protease Solution,倒置 56 次混合,室溫放置 5 分鐘。 (5)加 350μl Neutralization Solution,倒置 56 次混合。 (6)室溫,最高轉(zhuǎn)速離心 10 分鐘,回收上清。 (7)將離心柱插入收集管中。 (8)將上清倒入離心柱中。 (9)室溫,最高轉(zhuǎn)速離心 1 分鐘,倒掉流穿液,將離心柱重新插入收集管中。 (10)加 750μl Wash Solution(加乙醇),最高轉(zhuǎn)速離心 1 分鐘,倒掉流穿液,將 離心柱重新插入收集管中。 (11)重復(fù)步驟(10)(用 250μl Wash Solution)。 (12)室溫,最高轉(zhuǎn)速離心 2 分鐘。 (13)將離心柱插入一個(gè)無(wú)菌的 1.5 ml 微量離心管中。 (14)在離心柱中加 50100μl NucleaseFree Water,室溫,最高轉(zhuǎn)速離心 1 分鐘。
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