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    實驗?zāi)康模?/strong>

    體外檢測蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用。用于驗證兩個已知蛋白的相互作用，或者篩選與已知蛋白相互作用的未知蛋白。

    實驗原理：

    利用重組技術(shù)將探針蛋白與GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通過GST與固相化在載體上的GTH（Glutathione）親和結(jié)合。因此，當與融合蛋白有相互作用的蛋白通過層析柱時或與此固相復(fù)合物混合時就可被吸附而分離。

    試劑：

    NaCl， KCl，Na2HPO4，KH2PO4，Triton-100，IPTG（Merck分裝），PMSF（Amersco），Cocktaier（Merck 539134），Immobilized Glutathione（PIERCE 15160）

    實驗操作程序：

    材料及試劑

    探針蛋白與GST融合的原核蛋白，裂解的細胞蛋白，或者組織蛋白提取物

    細胞蛋白裂解液，洗脫液：

    PBS及PBS+1%Triton-100

    PBS （1L）

    NaCl：         8g

    KCl：          0.2g

    Na2HPO4：     1.44g

    KH2PO4：      0.24g

    加入800ml蒸餾水，用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，最后加蒸餾水定容至1L即可，高溫高壓滅菌！4℃保存?zhèn)溆茫?br />
    PMSF（苯甲基磺酰氟） MW:174.19 工作濃度0.1-1mM，這里使用1mM，儲存濃度100mM，將0.174g PMSF溶于10ml無水乙醇混勻即可！保持于-20℃或者4℃

    （以下流程僅供研究已知原核蛋白A和真核過表達蛋白B相互作用）

    1：原核融合蛋白A的獲得

    1.1：將編碼蛋白A與GST的重組質(zhì)?；D(zhuǎn)BL21（DE3）菌株

    1.2：挑取單個克隆到含有5mlLB（+100ug/mlAmp）的10ml試管里，37℃培養(yǎng)過夜

    1.3：將培養(yǎng)菌液轉(zhuǎn)移到含有500ml LB（+100ug/mlAmp）的1L錐形瓶中，37℃，225rpm培養(yǎng)至OD600≈1.0-1.5左右，加入適當濃度的IPTG，在適當溫度下培養(yǎng)適當時間（誘導條件需要根據(jù)不同的蛋白做調(diào)整），6000g，10分鐘，4℃離心收集細菌，去盡上清，將菌體至于-20℃放置

    1.4：室溫凍融菌體，馬上置于冰上，每500ml培養(yǎng)液加入10-20ml細菌裂解液（PBS+1%Triton-100+PMSF），吹打混勻

    1.5：冰上超聲破碎，開2秒，停9秒，總40-60分鐘。至裂解液充分清涼

    1.6：11000rpm，15分鐘，4℃離心分離上清， -80℃保存?zhèn)溆?br />
    2：真核融合蛋白B的獲得

    2.1：將編碼B蛋白的堿基序列克隆到編碼標簽蛋白（如HA,或者myc）的真核表達載體上，進行細胞轉(zhuǎn)染

    3：48小時后，取適量融合蛋白GST-A冰上凍融

    4：取50-70ulGST-Beads（Immobilized Glutathione）到EP管中，用800ul PBS+1%Triton-100潤洗一次，將凍融融合蛋白GST-A與之混勻，4℃層析柜旋轉(zhuǎn)結(jié)合1小時。

    5：PBS+1%Triton-100洗3次，PBS洗3次。留取20ul（ PBS+Beads）作Offer。

    6：同時，裂解真核融合蛋白B，去盡培養(yǎng)基，用PBS（RT）洗一次，加入300ul裂解液（以6well為例，PBS+1%Triton-100+ Cocktaier），4℃放置30分鐘。

    7：吹打收集至1.5mlEP管，超聲破碎。13000rpm，15分鐘，4℃離心取上清。

    8：BCA蛋白定量（optional）留取20ul做Offer，其余樣品加入到已純化蛋白的EP管中，用PBS補足液體到600ul左右，以便蛋白之間能充分結(jié)合！4℃旋轉(zhuǎn)結(jié)合O/N9：PBS+1%Triton-100洗3次，PBS洗3次。

    10：40ul 5×loading buffer溶解beads上的蛋白，煮沸3分鐘，高速離心，Run –SDS PAGE做Western Blot檢測。用HA或者myc Blot。